1型鴨肝炎病毒2C蛋白亞細胞定位及NTP酶活功能檢測.pdf

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2、月摘要鴨甲型病毒陛肝炎(DuckhepatitisAvirus1，DHAV1)屬于小RNA病毒科的成員，主要感染4周齡以下的雛鴨，對養(yǎng)殖業(yè)危害極大。2C蛋白位于DHAV1編碼的多聚蛋白的P2區(qū)，其它小RNA病毒的研究表明，2c蛋白是一種非結(jié)構(gòu)蛋白且在病毒復制復合體的形成過程中起至關重要的作用，但目前未見對DHAV12C蛋白特性及功能研究的報道。本文在對DHAV12C蛋白進行原核表達的基礎上，制備出2C蛋白多克隆抗體，檢測了DHAV12C

3、在鴨胚成纖維(DEF)細胞內(nèi)的分布情況，同時對2C的NTP酶活性及影響酶活性的關鍵位點進行了研究，試驗結(jié)果如下：1DH瓜，12C蛋白的表達、多克隆抗體的制備及亞細胞定位檢測將正確擴增的2C片段連入pET32a上，成功構(gòu)建了pEY32a2C原核表達載體，將pET32a2C轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rossta(DE3)PP，IPTG誘導后2C以不溶生性包涵體的形式表達，Westernblot鑒定后可被組氨酸標簽抗體識別，大小約為50kDa，純化2C蛋白

4、，免疫鼠獲得了2C蛋白的多克隆抗體。將2C片段連入pEGFPC2中，轉(zhuǎn)染DEF細胞，觀察2C蛋白單獨表達時在細胞中的定位『青況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24h的2C蛋白在核質(zhì)均有分布。將DHAV1感染DEF，間接免疫熒光檢測病毒增殖過程中2C蛋白在細胞內(nèi)的分布情況，結(jié)果顯示：在病毒感染后4h以前2C蛋白分布在胞漿，6ll后開始入核，20h后全部入核，且隨著時間的延長不再出核；進一步對2C在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的亞細胞定位進行檢測，結(jié)果顯示，DHA

5、V1感染DEF4h后2C蛋白可分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。2DHAV12C蛋白的NTP酶活性及酶淆陛關鍵位點的研究將麥芽糖結(jié)合蛋白@仍P)片段加在2C序列的N’端后連入pET28a并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rossta(DE3)，IPTG誘導表達后獲得了可溶f生的2C重組融合蛋白。Westernblot鑒定表明，2C重組融合蛋白可被組氨酸抗體識別，重組融合蛋白的大小為75kDa。純化2C鶯組融合蛋白，用磷酸檢測試劑盒可檢測到原核表達的可溶性2C重組融合