FOXA1基因變異和調(diào)控異常促進(jìn)肝癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌是常見(jiàn)的高度惡性腫瘤，其病程短、發(fā)展快、死亡率高，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。由于肝癌發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，科學(xué)界對(duì)其發(fā)病原因尚無(wú)定論，已知的誘因包括病毒感染、黃曲霉毒素?cái)z入、肝臟長(zhǎng)期慢性炎癥、肝硬化等，而性別差異是HCC發(fā)生發(fā)展的一個(gè)非常重要的特征。人群流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn):男性HCC平均發(fā)病率是女性的3-5倍，而對(duì)于年齡在50歲以下的男性，HCC發(fā)病率則達(dá)到女性的7-10倍。在預(yù)后方面，男性患者生存率低、生存期短，而女性治療后具有相對(duì)較高

2、的生存率和較低的復(fù)發(fā)率。目前普遍認(rèn)為:這種性別差異主要是由男女體內(nèi)性激素水平及相應(yīng)受體(AR和ER)的差異引起的。
　　在對(duì)前列腺癌和乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子FOXA1廣泛地參與AR和ER通路，影響腫瘤進(jìn)程。在前列腺癌中，F(xiàn)OXA1影響AR對(duì)其下游基因的調(diào)控，F(xiàn)OXA1的高表達(dá)，與前列腺癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)顯著相關(guān);在乳腺癌中，ER對(duì)其下游基因的調(diào)控需要FOXA1的參與，F(xiàn)OXA1的高表達(dá)，預(yù)示更長(zhǎng)的無(wú)病生存期和總生存期。那么，作為同

3、樣具有性別差異的肝癌來(lái)說(shuō)，F(xiàn)OXA1是否也發(fā)揮著相同或相似的功能呢？
　　2012年，Li等人報(bào)道:用肝癌誘導(dǎo)藥物作用于Foxa1基因敲除的小鼠，原本不易誘發(fā)肝癌的雌性小鼠變得容易罹患肝癌，而雄性小鼠卻不易誘發(fā)肝癌，從而第一次證明FOXA1在肝癌發(fā)生及性別差異中發(fā)揮了舉足輕重的作用，其功能或表達(dá)水平異常會(huì)嚴(yán)重影響肝臟的正常生理功能。
　　基于前人的研究結(jié)果，本論文從FXA1基因變異和調(diào)控異常兩個(gè)方面著手，對(duì)FOXA1與肝癌發(fā)

4、生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　第一章 FOXA1基因變異與肝癌易感性的關(guān)聯(lián)及其機(jī)制研究
　　肝癌的發(fā)生是內(nèi)因、外因共同作用的結(jié)果。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn):個(gè)體是否患肝癌在很大程度上取決于個(gè)體的遺傳易感性。對(duì)肝癌患者及其親屬的研究表明:遺傳因素與肝癌的發(fā)生具有顯著的關(guān)聯(lián)。找到與遺傳易感性相關(guān)的基因或基因變異，并發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致肝癌發(fā)生的機(jī)制，對(duì)于肝癌的防治具有重要意義。
　　我們前期的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn):FOXA1基因編碼區(qū)第247位

5、堿基多態(tài)性(rs7144658，A247G，Thr83Ala)與肝癌易感性顯著相關(guān)(P＜0.05)。為了從生物學(xué)角度解釋關(guān)聯(lián)的結(jié)果，我們借助ChIP-qPCR和報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等技術(shù)手段開(kāi)展了FOXA1基因變異增加肝癌易感性的機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:OXA1基因編碼區(qū)第247位堿基由A變異為G后，其與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力顯著降低（P＜0.05），從而影響FOXA1調(diào)控的靶基因的表達(dá)水平，增加FOXA1/+247G基因型攜帶者的肝癌易感性

6、。
　　本章的主要內(nèi)容如下:
　　1.FOXA1基因編碼區(qū)第247位堿基A/G多態(tài)性與肝癌易感性顯著相關(guān)?；诒臼仪捌诘臉颖?對(duì)照分析研究發(fā)現(xiàn):FOXA1基因編碼區(qū)第247位堿基多態(tài)性(rs7144658，A247G，Thr83Ala)與肝癌易感性顯著相關(guān)（P＜0.05），SNP+247A＞G的A/G及G/G基因型比A/A基因型顯著增加肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)(P＜0.05; OR,1.35;95％CI,1.09-1.67)。

7、　　2.FOXA1基因編碼區(qū)第247位堿基A到G變異減弱FOXA1與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力。在HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FOXA1/247A和pcDNA3.1-FOXA1/247G后，開(kāi)展ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):FOXA1/247G對(duì)其調(diào)控基因（如DIO1、UGT2B17、p27Kip1和NTCP）的啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力顯著低于FOXA1/247A(P＜0.05)。
　　3.FOXA1基因編碼區(qū)第24

8、7位堿基A到G變異影響FOXA1的轉(zhuǎn)錄激活能力。通過(guò)對(duì)DIO1、UGT2B17、p27Kip1和NTCP的報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，我們證實(shí):FOXA1/247G對(duì)DIO1和UGT2B17的轉(zhuǎn)錄激活能力低于FOXA1/247A，對(duì)p27Kip1的轉(zhuǎn)錄激活能力高于FOXA1/247A，而對(duì)NTCP的轉(zhuǎn)錄激活能力沒(méi)有明顯差別，說(shuō)明該位點(diǎn)變異會(huì)影響FOXA1對(duì)其靶基因的轉(zhuǎn)錄激活能力。
　　4.肝癌組織樣本中FOXA1基因編碼區(qū)第247位堿基多態(tài)性影

9、響靶基因表達(dá)水平。為了從組織水平驗(yàn)證我們的結(jié)論，我們對(duì)97例外科手術(shù)切除的肝癌組織進(jìn)行了基因分型，其中67例為A/A基因型，27例為A/G基因型，3例為G/G基因型。隨后我們分別檢測(cè)了這些組織中DIO1、UGT2B17、p27Kip1和NTCP基因的mRNA水平。在A/G和G/G基因型組織樣本中，DIO1基因（P＜0.05）和UGT2B17（P＜0.05）基因表達(dá)水平均顯著低于A/A基因型組織樣本，p27Kip1基因（P＜0.0001）

10、表達(dá)水平顯著高于A/A基因型組織樣本，NTCP基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，以上結(jié)果與報(bào)告基因結(jié)果完全一致。
　　5.ER影響FOXA1與基因組DNA的結(jié)合能力，且對(duì)FOXA1/247A和FOXA1/247G的影響程度不同。ER雖然不影響FOXA1結(jié)合到NTCP基因啟動(dòng)子區(qū)的能力，但是卻能增強(qiáng)FOXA1蛋白結(jié)合到DIO1基因啟動(dòng)子區(qū)的能力。對(duì)于UGT2B17和p27Kip1，ER能夠減弱FOXA1結(jié)合到他們的啟動(dòng)子區(qū)，且對(duì)FOXA1/

11、247A的影響程度大于FOXA1/247G。
　　6.ER影響FOXA1的轉(zhuǎn)錄激活能力，且對(duì)FOXA1/247A和FOXA1/247G的影響程度不同。ER一方面可以增強(qiáng)FOXA1對(duì)DIO1、UGT2B17和NTCP基因的轉(zhuǎn)錄激活能力，擴(kuò)大FOXA1/247A與FOXA1/247G對(duì)DIO1轉(zhuǎn)錄激活能力的差異，另一方面可以減弱FOXA1對(duì)p27Kip1的轉(zhuǎn)錄激活能力，消除FOXA1/247A與FOXA1/247G對(duì)p27Kip1基因

12、轉(zhuǎn)錄激活能力的差異。
　　7.FOXA1基因編碼區(qū)第247位堿基A到G變異減弱FOXA1與ER的親和能力。在HepG2細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)FOXA1/247A和FOXA1/247G后，我們通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)不僅驗(yàn)證了FOXA1與ER存在相互作用，還發(fā)現(xiàn)FOXA1/247G與ER的親和力約為FOXA1/247A的40％，這從一定程度上解釋了先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　FOXA1作為肝臟核因子之一，在維持肝臟正常功能中發(fā)揮著不可替代的作用

13、，其基因變異所引起的轉(zhuǎn)錄功能異常會(huì)影響肝臟的正常生理功能，從而增加機(jī)體患癌的風(fēng)險(xiǎn)。
　　FOXA1在肝癌發(fā)生中起到抑癌作用還是促癌作用目前還沒(méi)有定論，科學(xué)界普遍傾向于它是一個(gè)抑癌因子，其功能異常會(huì)增加機(jī)體患癌的風(fēng)險(xiǎn)。我們的研究結(jié)果也支持“FOXA1是一個(gè)抑肝癌因子”的結(jié)論，其基因編碼區(qū)第247位堿基A→G變異，會(huì)降低FOXA1結(jié)合其調(diào)控基因啟動(dòng)子區(qū)的能力，引起下游基因在轉(zhuǎn)錄水平上的變化，這些基因表達(dá)水平的變化勢(shì)必會(huì)影響到肝臟的正常

14、功能，使機(jī)體長(zhǎng)期處于一種“亞健康狀態(tài)”，減弱機(jī)體抵抗內(nèi)在及外在致癌因素的能力，從而增加個(gè)體罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。
　　第二章 FOXA1介導(dǎo)WT1促肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究
　　肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是肝癌致死的最主要原因，也是臨床肝癌治療和預(yù)防的最大挑戰(zhàn)。肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是一個(gè)多步驟形成、多基因參與并不斷變化的過(guò)程，與肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)的分子標(biāo)志物和治療靶標(biāo)也非常的復(fù)雜多樣。因此，找到與肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)的基因并發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)于肝癌

15、的治療具有重要意義。
　　在本部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)FOXA1基因的表達(dá)受到WT1的調(diào)控，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明:WT1在肝癌細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)會(huì)使FOXA1的表達(dá)長(zhǎng)期處于較高的水平，F(xiàn)OXA1表達(dá)量的變化，又使其對(duì)下游基因（如AFP、AGR2、p27Kip1等）的調(diào)控發(fā)生異常，最終促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移能力。
　　本章的主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.WT1、FOXA1、AGR2蛋白表達(dá)量與肝癌轉(zhuǎn)移能力正相關(guān)。在對(duì)不同侵襲能力的肝/肝癌細(xì)胞

16、系蛋白表達(dá)水平檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn):WT1、FOXA1、AGR2蛋白表達(dá)水平均隨肝癌細(xì)胞侵襲能力增加而增加，并呈現(xiàn)顯著的一致性。侵襲能力最強(qiáng)的MHCC97H細(xì)胞中具有最高的蛋白表達(dá)水平，侵襲能力稍弱的MHCC97L細(xì)胞中，蛋白表達(dá)水平有所降低，在其他侵襲能力較弱甚至無(wú)侵襲能力的細(xì)胞系（L02、Chang's、HepG2、Hep3B和Huh7）中表達(dá)水平顯著降低甚至檢測(cè)不到他們的表達(dá)。
　　2.WT1正調(diào)控FOXA1的表達(dá)。在過(guò)表達(dá)WT

17、1不同剪接體的HepG2細(xì)胞中，除了WT1-1組，其他三組中FOXA1的蛋白表達(dá)水平均顯著升高。經(jīng)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí):WT1可以上調(diào)FOXA1的表達(dá)水平。隨后，我們以不同濃度的pcDNA3.1-WT1-4質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示:FOXA1及AGR2熒光素酶活性隨著WT1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度的增加而呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。
　　3.WT1不影響細(xì)胞的增殖能力，但其剪切體WT1-4可以顯著增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的增殖能力。在MHC

18、C97H細(xì)胞中下調(diào)WT1的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明WT1并不影響細(xì)胞的增殖能力。但是在HepG2細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)WT1剪接體WT1-1和WT1-4后，WT1-1組細(xì)胞增殖能力沒(méi)有明顯變化，而WT1-4組細(xì)胞增殖能力顯著上升。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)證實(shí):WT1-4可以使HepG2細(xì)胞更多的處于G2/M期而進(jìn)入細(xì)胞增殖分裂程序。以上結(jié)果說(shuō)明:從整體水平上看，WT1不影響肝癌細(xì)胞的增殖能力，但是WT1第四種剪接體WT1-4具有促進(jìn)肝癌

19、細(xì)胞增殖的功能。
　　4.WT1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外遷移能力。在MHCC97H細(xì)胞中下調(diào)WT1的表達(dá)，細(xì)胞的遷移能力受到明顯地抑制。在HepG2細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)WT1的剪接體WT1-1和WT1-4后，WT1-1組細(xì)胞的遷移能力沒(méi)有明顯變化，而WT1-4組細(xì)胞的遷移能力顯著上升，說(shuō)明WT1能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外遷移能力，而其促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外遷移能力可能是通過(guò)WT1-4來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　5.WT1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外侵襲能力。在MH

20、CC97H細(xì)胞中下調(diào)WT1的表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲能力受到明顯地抑制。在HepG2細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)WT1的剪接體WT1-1和WT1-4后，WT1-1組細(xì)胞的侵襲能力沒(méi)有明顯變化，而WT1-4組細(xì)胞的侵襲能力顯著上升，說(shuō)明WT1能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外侵襲能力，而其促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外侵襲能力可能是通過(guò)WT1-4來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　本章研究發(fā)現(xiàn):WT1可以正調(diào)控FOXA1基因的表達(dá)，進(jìn)而影響AGR2等FOXA1下游基因的表達(dá)水平，促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移