白念珠菌中核苷酸類物質(zhì)分析方法的建立及其在代謝組學(xué)應(yīng)用研究.pdf

1、核苷酸類化合物具有重要的生物學(xué)功能，核苷酸不僅是DNA和RNA的前體而且在代謝中扮演重要角色，例如存儲和轉(zhuǎn)運(yùn)代謝的能量與細(xì)胞的信號，并且參與了輔酶因子的反應(yīng)等。另一方面，糖核苷酸是生物體內(nèi)糖基化過程中糖基的供體，該類化合物中最常見的是尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-GLC)，它是真菌細(xì)胞壁中β(1，3)-D-葡聚糖合成過程中的重要底物。核苷酸類物質(zhì)在生物體內(nèi)廣泛存在，精確地測定生物樣品中核苷酸及糖核苷酸的含量對于了解細(xì)胞的能量代謝水平，認(rèn)識

2、細(xì)胞的周期調(diào)節(jié)及藥物作用機(jī)制有十分重要的作用。
　　 核苷酸與糖核苷酸是代謝通路中的近鄰，它們的物理化學(xué)性質(zhì)相似，因此通?？梢云叫蟹治觥Ｓ捎跇O性較大，這類物質(zhì)使用常規(guī)的反相色譜法無法進(jìn)行分離。目前，國內(nèi)外測定核苷酸類物質(zhì)的方法主要有，離子交換液相色譜法、離子對色譜法、親水色譜法和毛細(xì)管電泳法。但對于某些成分的分離不甚理想，不能滿足實驗的要求。因此本實驗在文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化條件，采用HPLC-ESI/MS方法對白念珠菌提取

3、物中的7種核苷酸和糖核苷酸[三磷酸胞苷(CTP)，三磷酸尿苷(UTP)，二磷酸尿苷(UDP)，三磷酸鳥苷(GTP)，三磷酸脫氧腺苷(dATP)，單磷酸腺苷(AMP)，二磷酸尿苷-葡萄糖(UDP-GLC)]進(jìn)行定量分析。這一定量方法通過了驗證并且成功地應(yīng)用于浮游型與被膜型白念珠菌的測定，及卡泊芬凈和5-氟胞嘧啶給藥后白念珠菌中的核苷酸類物質(zhì)變化的測定。
　　 白念珠菌是侵襲性真菌感染中常見的條件致病菌，體外抗菌藥物敏感性實驗發(fā)現(xiàn)，

4、當(dāng)其產(chǎn)生胞外多聚基質(zhì)形成生物被膜后會表現(xiàn)高度耐藥性。本實驗借助卡泊芬凈(CAS)、5-氟胞嘧啶(5-FC)、黃芩素(BE)及魚腥草素鈉[Sodium Houttuyfonate(SH)]這四個作用機(jī)制不同的藥物對真菌耐藥機(jī)理及一些藥物的抗真菌作用部位、機(jī)制以及毒性等進(jìn)行探究。目前，國內(nèi)外主要是在基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的層次上對真菌進(jìn)行研究，而在代謝組學(xué)方面的研究則相對較少，由于代謝物是細(xì)胞調(diào)控過程的終產(chǎn)物，它們的種類和數(shù)量變化被視為生物系

5、統(tǒng)對基因或環(huán)境變化的最終響應(yīng)，因此，與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)相比，代謝組學(xué)具有一定的優(yōu)越性，值得進(jìn)一步深入研究。
　　 本課題采用了LC-MS，GC-MS等高通量儀器分析與數(shù)學(xué)解析相結(jié)合的代謝組學(xué)技術(shù)，進(jìn)行生物被膜型白念珠菌耐藥性及抗真菌藥物機(jī)制的代謝組學(xué)研究。通過比較正常生物被膜型與浮游型白念珠菌、給藥處理的被模型與浮游型白念珠菌，考察藥物處理前后白念珠菌的代謝特征譜差異，結(jié)合代謝通路數(shù)據(jù)庫及其相關(guān)的藥物機(jī)制，尋找與藥物機(jī)制相關(guān)

6、的代謝物和相應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)。旨在為研究白念珠菌復(fù)雜的致病機(jī)制和耐藥機(jī)制開辟新思路，為新的抗真菌藥物做貢獻(xiàn)。
　　 麥角甾醇是真菌細(xì)胞質(zhì)膜的重要成分，它參與多種細(xì)胞生物功能，包括細(xì)胞膜的完整性、流動性和鍵合在細(xì)胞膜上的酶的作用。角鯊烯和羊毛甾醇是麥角甾醇合成途徑中主要的前體。因麥角甾醇及其合成通路是一些臨床一線藥物的作用靶點，如多烯類藥物包括兩性霉素及其衍生物、制霉菌素等。因此有必要對白念珠菌中的甾醇類物質(zhì)進(jìn)行測定以研究抗真菌藥物的

7、作用機(jī)制。
　　 為了研究不同藥物對白念珠菌中甾醇含量的影響，本文建立了一個精確靈敏的GC-SIM-MS方法測定羊毛甾醇和麥角甾醇的含量。白念珠菌經(jīng)離心、皂化、提取出甾醇部分后溶解于環(huán)己烷中，采用HP-5（30m×0.25mm×0.25μm）毛細(xì)管柱進(jìn)行氣相色譜分析，單重四級桿質(zhì)譜選擇離子檢測(SIM)羊毛甾醇、麥角甾醇和膽固醇（內(nèi)標(biāo)），以保留時間和碎片信息進(jìn)行定性定量分析。由于甾醇類化合物本身的揮發(fā)性比較好，適合采用氣質(zhì)聯(lián)用方