人肝癌細胞HepG2中核苷酸類物質(zhì)的分析方法建立及其代謝變化的初步研究.pdf

1、本文從人肝癌細胞HepG2的基本培養(yǎng)入手，對于細胞培養(yǎng)過程中所需要的傳代、凍存、復蘇等基礎(chǔ)而必需的實驗環(huán)節(jié)進行了摸索和完善；繪制了該細胞系的生長曲線，并觀察了處于對數(shù)生長期細胞的形態(tài)；研究了三種作用機制完全不同的臨床常用藥物(5-氟尿嘧啶、長春新堿、絲裂霉素C)對其的抑制情況，包括抑制曲線和半數(shù)抑制濃度(IC50)。通過比較，從抑制效果、用藥劑量和藥物穩(wěn)定性綜合評價，確定在藥物篩選實驗中，這三種藥物中的硫酸長春新堿是最適宜作為陽性藥物的

2、。 以氫氧化四丁基銨鹽作為離子對試劑，應(yīng)用離子對反相高效液相色譜技術(shù)對該細胞中的三磷酸核糖核苷酸和三磷酸脫氧核糖核苷酸的分離進行了系統(tǒng)深入的研究，分別考查了流動相中有機相的種類、濃度和pH值，以及檢測器的檢測波長、流速和柱溫，最終確定的分離條件為：流動相A：10mM氫氧化四丁基銨、10mM KH2PO4，以H3PO4調(diào)節(jié)’pH=7；流動相B：5.6mM氫氧化四丁基銨、50mM：KH2PO4、30％甲醇，以NaOH調(diào)節(jié)pH=7。梯

3、度洗脫程序如下：0-50min，60％B-90％B；50-75min，90％B。流速：0.4 mL/min，檢測波長：260nm；進樣量：50μL，柱溫：20℃。經(jīng)方法學驗證，本方法的色譜分離選擇性好，各待測物在各自的濃度范圍內(nèi)線性良好r＞0.9994，加樣回收率94％～106％，日內(nèi)精密度RSD＜3％，日間精密度RSD＜6％，12小時穩(wěn)定性RSD＜4％，均符合要求。 毛細管區(qū)帶電泳和親水色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的分離機理與離子對高效液相

4、色譜法完全不同。它們對于結(jié)構(gòu)相似且極性較大物質(zhì)的分離分析是非常有效的。 建立了毛細管區(qū)帶電泳對于這類物質(zhì)的分離方法。分別對電泳的緩沖液種類和濃度、pH值、運行溫度、運行電壓、有機改性劑、毛細管柱長度、毛細管柱內(nèi)徑進行了考查，最終優(yōu)化出下列條件：運行緩沖液為40mM硼酸鈉，pH=9.45，毛細管長度49.0cm×50μm(有效長度40.5cm)，正極進樣，負極檢測，兩次進樣之間用1M NaOH、緩沖溶液各沖洗5min。壓力進樣50

5、mbar×3s，分離電壓為18 kV，分離溫度為15℃，紫外檢測波長為260nm。本方法可以實現(xiàn)待測物混合標準品的良好分離。 建立了親水色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對于這類物質(zhì)的測定方法。以氨基柱作為親水色譜柱，應(yīng)用親水色譜法串聯(lián)質(zhì)譜，并采取選擇離子監(jiān)測的模式，分別優(yōu)化了流動相的緩沖鹽種類、濃度和pH值，以及質(zhì)譜檢測器的檢測模式、提取離子質(zhì)荷比等條件，具體條件如下：92％20mM乙酸銨(pH=9.5)+8％乙腈，等度洗脫65分鐘，柱溫：25℃

6、；流速：1 mL/min；檢測波長：260nm；分流比：4：1；進樣量：10μL。本方法可以實現(xiàn)對待測物的分離。 結(jié)合代謝組學的理念，這三種作用機制完全不同的臨床常用藥物--5-氟尿嘧啶、長春新堿和絲裂霉素C作為外界擾動，給予細胞刺激，提取胞內(nèi)物質(zhì)，研究并比較經(jīng)不同藥物作用后細胞內(nèi)三磷酸核糖核苷酸的代謝特點，將這些物質(zhì)的變化與其合成和代謝途徑，以及藥物的作用機制聯(lián)系并加以驗證。經(jīng)3種藥物作用后，ATP含量均下降，提示與ATP代謝

7、有關(guān)，對其進行含量測定，可作為三磷酸腺苷生物發(fā)光法的佐證，應(yīng)用于抗腫瘤藥物篩選實驗中。經(jīng)長春新堿作用后，GTP和ATP含量下降，其中GTP的變化提示與長春新堿對于微管的作用有關(guān)。經(jīng)絲裂霉素C后，GTP和ATP含量下降，提示與絲裂霉素C與嘌呤類核苷酸的交聯(lián)有關(guān)。經(jīng)5-氟尿嘧啶作用后，CTP、GTP、ATP均下降，原因有待進一步考查。雖然本研究并未對4種三磷酸核糖核苷在藥物作用后的變化機理全部進行解釋，但是所得結(jié)論足以說明體內(nèi)生理生化過程與