通過高通量篩選技術(shù)從中藥材中發(fā)現(xiàn)抗黑色素瘤的新天然化合物.pdf

1、黑色素瘤在最常見的癌癥中排第六位，它惡性程度很高，是最危險的皮膚癌。黑色素瘤同時也是一個主要的健康問題，近年來它在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率有所升高。浸潤性黑色素瘤的發(fā)病率在白人中最高，幾乎是其他人種發(fā)病率的30倍。在65歲及65歲以上的人群中，黑色素瘤在男性中發(fā)病的可能性要比在女性中高出2倍（在女性和男性中的發(fā)病率分別為1/35和1/25），每年發(fā)病大約有100，000例。根據(jù)世界衛(wèi)生組織下屬的國際癌癥研究署的數(shù)據(jù)，皮膚黑色素瘤發(fā)病率最高的國

2、家是澳大利亞和新西蘭。黑色素瘤的發(fā)病率一直上升，但是用來治療黑色素瘤的手段有限，因此死亡率也有所上升。
　　用來阻止黑色素瘤轉(zhuǎn)移和殺死癌細胞的化療手段包括:烷基化試劑（如氮烯咪胺，有效率在15％-20％之間），鉑類藥物（如順鉑，單獨治療有效率為15％左右），微管毒素藥物（如紫杉醇，單獨使用時有效率為16％左右），這些藥物的療效不理想和藥物的副作用是化療的主要問題。從總體療效和存活率來看，當(dāng)前轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療手段還有待提高。雖然

3、一些藥物在生物化學(xué)實驗中表現(xiàn)出了不錯的結(jié)果，但是沒有一種藥物或者是手段能在隨后的試驗中提高反應(yīng)的中間期和生存率。來源于植物和草藥的天然產(chǎn)物，單獨使用或者聯(lián)合其他藥物使用，也許會提供治療惡性黑色素瘤的一種新的治療方法。
　　天然產(chǎn)物一直是藥物先導(dǎo)化合物的最成功的來源，天然產(chǎn)物能提供大于標(biāo)準(zhǔn)組合化學(xué)所能提供的結(jié)構(gòu)多樣性，天然產(chǎn)物也是新型的低分子量的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的主要來源，這些先導(dǎo)化合物具有針對多個靶點的活性。中藥經(jīng)過了歷史上千年的檢驗，有

4、助于天然活性成分（尤其是用于醫(yī)療用途的活性成分）的確定，也許將推動世界范圍內(nèi)新藥的研發(fā)。源于中藥的天然產(chǎn)物在治療癌癥中有很大潛力，例如青蒿琥酯，高三尖杉酯堿，As2O3，斑蝥素。對照臨床研究發(fā)現(xiàn)，高三尖杉酯堿和As2O3對治療白血病有顯著活性。對中藥來源的藥物的分子機制越來越多的了解及其最近在應(yīng)用方面的發(fā)展證實了:中藥和現(xiàn)代尖端科技的結(jié)合可以為發(fā)展新型和改良型抗癌藥物提供非常引人注目的策略。
　　高通量篩選是發(fā)現(xiàn)有望在不久的將來用

5、于癌癥有效治療而副作用少的天然小分子的新策略，也是加速其分離，鑒定及表征過程的新策略。在本文中，用高通量篩選的方法對源于500種中藥的組分庫的抗黑色素瘤的活性進行了初步篩選，確定了兩個具有抗黑色素瘤和其他腫瘤活性的天然小分子。
　　使用基于高通量篩選的新策略來系統(tǒng)地針對藥物靶點進行中藥活性物質(zhì)的篩選并確定。用于篩選的組分庫由中國藥典常見的500種中藥構(gòu)成，這些中藥有各種活性成分，能夠治療包括腫瘤在內(nèi)的很多疾病。為構(gòu)建中藥組分庫，每

6、種中藥粉末用95％乙醇在索氏提取器內(nèi)95℃回流提取10小時，然后用制備型高效液相色譜(HPLC)收集組分。每種中藥粗提物經(jīng)處理后，用10％-100％甲醇梯度洗脫（每個組分中可見峰在1-17個），收集80個組分，由此得到了來源于500種中藥的適合高通量篩選的40，000個組分。假定每個組分中的各種物質(zhì)的平均分子量為500道爾頓，將每個組分用DMSO溶解成20 mM溶液置于96孔板中構(gòu)成直接用于篩選的組分庫。有活性的單體化合物由進一步的活性

7、引導(dǎo)分離得到并進行結(jié)構(gòu)鑒定。
　　用于篩選抗黑色素瘤中藥組分的終濃度為100μ M。用A375細胞系篩選了源于240種中藥的19，200個組分，其中67種中藥的154個組分表現(xiàn)出了抑制黑色素瘤細胞生長的活性。隨后進行了陽性組分對新鮮分離的小鼠脾細胞的毒性試驗，以排除對正常細胞有毒性的組分。結(jié)果顯示，110個組分具有顯著的細胞毒性，44個組分沒有明顯的毒性。因其抗黑色素瘤活性好而且對小鼠脾細胞毒性小，艾葉被選擇以分離其中具有抑制黑色

8、素瘤活性的化合物。有機溶劑萃取和制備型HPLC收集組分被用來分離艾葉中的活性成分。最終從艾葉中得到兩種能夠抑制A375細胞增殖的化合物，通過質(zhì)譜，1H NMR和13C NMR，確定其結(jié)構(gòu)為(O)-甲基黃酮-異澤蘭黃素（5，7-二羥基-3'，4'，6-三甲氧基黃酮）和棕矢車菊素（4，5，7-三羥基-3'，6-二甲氧基黃酮）。
　　檢驗異澤蘭黃素對A375細胞的抑制增殖效應(yīng)的MTT測試結(jié)果表明，其EC50大約為150μM。異澤蘭黃素特

9、異性地誘導(dǎo)A375細胞形態(tài)變化，對正常的小鼠脾細胞的毒性較小。進一步研究顯示其對A375細胞生長呈現(xiàn)劑量依賴的抑制作用，與DNA損傷，細胞凋亡和細胞周期阻滯在G2/M期有關(guān)。異澤蘭黃素誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)通過Annexin V-FITC/PI雙染色并由流式細胞儀進行檢測得到證實。結(jié)果顯示:150μM和300μM的異澤蘭黃素處理的細胞凋亡率分別為13.05％和29.20％，而對照組的細胞凋亡率只有2.04％。同時也進行了Hoechst33258

10、染色來檢測細胞凋亡（很容易檢測到細胞核中的DNA斷裂）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示異澤蘭黃素處理引起細胞周期阻滯，濃度為150μM和300μM的藥物處理細胞24h后，G2/M期的細胞由對照組的8.82％上升到21.70％和29.86％。
　　以上結(jié)果表明，使用中藥組分庫進行高通量篩選的策略在發(fā)現(xiàn)抗腫瘤的天然小分子中是行之有效的方法。兩種具有抗黑色素瘤活性的黃酮類化合物值得進一步的機制和療效研究。對本研究中發(fā)現(xiàn)的其它中藥陽性組分中單體化