R10，新型p38 MAPK抑制劑生物學(xué)功能研究.pdf

1、p38 MAPK最初作為巨噬細(xì)胞中一種受脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的酪氨酸磷酸化蛋白而被鑒定出來(lái)，目前有p38α、p38β、p38δ和p38γ四種亞型。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)介導(dǎo)信號(hào)通路的重要分支，參與到炎癥、增殖、凋亡等多種生理過(guò)程。其中以在炎癥方面作用最為突出:促炎因子、趨化因子、降解酶類、生長(zhǎng)因子、粘附分子

2、以及其它炎癥因子的產(chǎn)生都依賴p38通路的調(diào)節(jié)。炎癥反應(yīng)失控可能導(dǎo)致動(dòng)脈硬化、癌癥等一系列嚴(yán)重疾病的發(fā)生。傳統(tǒng)抗炎藥物雖然能夠緩解炎癥狀況，但是顯著的副作用讓人們不得不尋找更好的抗炎藥物。目前，以阻斷炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路為導(dǎo)向的研發(fā)策略已經(jīng)成為抗炎藥物研發(fā)的主流趨勢(shì)。由于p38MAPK通路在炎癥反應(yīng)中占有重要地位，所以如何在信號(hào)通路水平阻斷和調(diào)控p38 MAPK的表達(dá)和活性以治療相關(guān)疾病已經(jīng)成為近年來(lái)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。迄今為止

3、，已經(jīng)有100多種p38抑制劑被報(bào)道，但是沒(méi)有一種能夠真正應(yīng)用的臨床治療當(dāng)中。大都止步于臨床試驗(yàn)階段的安全性檢驗(yàn)過(guò)程。尋找一種安全、高效的p38抑制劑已經(jīng)迫在眉睫。
　　利用生物信息學(xué)手段對(duì)現(xiàn)有的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、挖掘，從而有效的為生物實(shí)驗(yàn)科學(xué)提供預(yù)測(cè)，已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的趨勢(shì)。本課題正是基于此結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期生物信息學(xué)對(duì)p38 MAPK家族進(jìn)行的能量統(tǒng)計(jì)偶聯(lián)分析預(yù)測(cè)得到的一段可能對(duì)p38 MAPK有抑制性作用的多肽序列的基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)

4、其生物學(xué)功能的研究達(dá)到尋找新型p38MAPK抑制劑的目的。與此同時(shí)對(duì)尋找蛋白激酶信號(hào)通路抑制劑的新研究模式進(jìn)行初步探索。
　　1、首先，我們?cè)隗w外合成了R10多肽，利用體外激酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究。我們分別研究了R10多肽對(duì)于p38 MAPK上游激酶MKK6對(duì)p38磷酸化、p38自身磷酸化和p38對(duì)其下游底物ATF-2的磷酸化三個(gè)水平的影響。觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)R10能夠明顯的抑制p38磷酸化其下游底物的過(guò)程，并且

5、抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)。但是，當(dāng)R10多肽的濃度達(dá)到一定濃度后，抑制作用趨于穩(wěn)定，即使提高R10的濃度也不會(huì)造成徹底的抑制。另外，R10多肽對(duì)于其他兩個(gè)水平的磷酸化沒(méi)有明顯的抑制作用。
　　2、在體外生物學(xué)功能得到驗(yàn)證后，我們又進(jìn)一步在細(xì)胞學(xué)水平對(duì)R10多肽的生物學(xué)功能進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。分別從p38 MAPK經(jīng)典的級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路和p38自身磷酸化的輔助通路進(jìn)行了研究。因?yàn)槲覀兊难芯渴菫檠装Y治療藥物做篩選物，我們放棄了傳統(tǒng)的細(xì)

6、胞轉(zhuǎn)染方法，而采用了直接讓R10多肽進(jìn)入細(xì)胞的方法。為了能夠?qū)10多肽順利的“運(yùn)輸”到細(xì)胞內(nèi)部并且發(fā)揮作用，我們采取了細(xì)胞穿透肽技術(shù)中經(jīng)典的TAT標(biāo)簽作為轉(zhuǎn)運(yùn)工具。并添加了綠色熒光蛋白EGFP作為示蹤因子構(gòu)建了His-TAT-EGFP-R10融合蛋白。結(jié)果表明我們成功的將R10多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入NIH/3T3細(xì)胞內(nèi)部，并且沒(méi)有影響其生物學(xué)功能。通過(guò)檢測(cè)p38 MAPK通路的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，His-TAT-EGFP-R10融合蛋白能夠有效的抑

7、制p38磷酸化ATF-2的過(guò)程，但是不會(huì)對(duì)p38 MAPK通路其他水平的磷酸化造成影響。并且證實(shí)了在His-TAT-EGFP-R10融合蛋白中是R10基團(tuán)發(fā)揮的抑制作用。
　　3、炎癥因子的釋放是炎癥反應(yīng)擴(kuò)大的重要環(huán)節(jié)之一，如果能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控炎癥因子的表達(dá)水平就能夠有效的調(diào)控炎癥反應(yīng)。因此，我們選擇了在受p38 MAPK通路調(diào)控的在炎癥反應(yīng)中具有重要地位的細(xì)胞因子——IL-8作為檢測(cè)指標(biāo)。在檢測(cè)技術(shù)上我們沒(méi)有選擇傳統(tǒng)的ELIS

8、A方法，而是選擇了節(jié)約樣本、高通量、高靈敏度的基于Luminex技術(shù)的液相蛋白芯片系統(tǒng)LiquiChip進(jìn)行檢測(cè)。觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，His-TAT-EGFP-R10融合蛋白在500 nmol/L時(shí)開(kāi)始對(duì)IL-8的表達(dá)產(chǎn)生明顯的抑制作用，當(dāng)濃度提高至1，000 nmol/L時(shí)，抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，在His-TAT-EGFP-R10融合蛋白中是R10基團(tuán)對(duì)IL-8的表達(dá)發(fā)揮了抑制作用。
　　4、XTT實(shí)驗(yàn)表明，His