小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型的建立及樹突狀細(xì)胞在其中的成熟變化.pdf

1、器官移植已成為治療各種終末期臟器衰竭的最佳選擇，但還遠(yuǎn)末完善。急性排斥反應(yīng)(acute rejection AR)仍然是影響移植成功的最大障礙，但其發(fā)生機制至今尚未完全明確，目前主要認(rèn)為是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答所引起。已有研究證實，抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells APC)可以通過直接識別和間接識別誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，從而介導(dǎo)急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，而樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells DC

2、)是機體內(nèi)最專職的APC，在啟動免疫應(yīng)答時需要經(jīng)歷成熟的過程，未成熟的樹突狀細(xì)胞(Immature dendritic cells iDC)低表達(dá)MHCⅡ類分子，只具有抗原吞噬的功能，當(dāng)受到危險信號刺激以后逐漸成熟，并向次級淋巴器官遷移，成熟的樹突狀細(xì)胞(Maturedendritic cells mDC)，表面高表達(dá)MHCⅡ及CD80、CD86等共刺激分子，共同介導(dǎo)導(dǎo)排斥反應(yīng)的發(fā)生。以上是關(guān)于急性排斥反應(yīng)機制的一些學(xué)說，仍然需要在體內(nèi)

3、實驗中進(jìn)一步證實。本課題首先成功建立小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型，繼而檢測樹突狀細(xì)胞在其中的成熟變化。
　　模型建立:將BALB/c和C57BL/6小鼠隨機分成三組:①對照組（BL/6→BL/6 n=5）;②移植組A(Balb/c→BL/6 n=6);③移植組B(BL/6→Balb/c n=6)。將供體心臟移植于受體腹部，供體心臟的升主動脈、肺動脈分別與受體腹主動脈、下腔靜脈行端側(cè)吻合。待移植心臟停跳后行蘇木精-伊紅染色(Hema

4、toxylin-Eosinstaining HE)，觀察移植物中淋巴細(xì)胞浸潤等組織學(xué)變化。結(jié)果行小鼠腹部異位心臟移植共20例，手術(shù)共成功17例，成功率為85％。對照組移植物僅有少量淋巴細(xì)胞浸潤，未發(fā)生排斥反應(yīng)，且移植物能長期存活;移植A組和B組移植物淋巴細(xì)胞浸潤明顯，均發(fā)牛排斥反應(yīng)，但兩組在排斥反應(yīng)評分及移植物存活時間上無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。小鼠心臟移植模型技術(shù)成熟，排斥判定相對容易，且成功率高，是比較可靠的急性排斥反應(yīng)模型

5、。C57BL/6小鼠由于轉(zhuǎn)基因品系更多，更適合作為受體。
　　樹突狀細(xì)胞數(shù)量及成熟度檢測:將小鼠心臟制成石蠟切片后，按常規(guī)方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry IHC)檢測。結(jié)果顯示:CD11c在對照組未見明顯表達(dá)，僅偶見黃色顆粒，而在移植A組及B組移植物中均呈陽性表達(dá)，顯著高于對照組(P＜0.01)，但是A、B兩組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.01)。待小鼠移植心臟停跳后制備DC單細(xì)胞懸液，然后利用流式細(xì)

6、胞術(shù)(Flow cytometry FCM)檢測MHCⅡ、CD45、CD11c和CD86的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與對照組和空白組相比，移植A組和B組移植物中淋巴細(xì)胞表面因子CD45的表達(dá)比例明顯上調(diào)(P＜0.05)，而樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)記物CD11c的表達(dá)比例明顯增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，同時發(fā)現(xiàn)其成熟標(biāo)記物CD86+MHCⅡ+的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。
　　利用TRIzol法提取心臟移植物組織中的總RNA，使用核酸

7、蛋白定量分析儀測定RNA濃度，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后利用IL-12、IFN-γ、TNF-α和CD11c、CD80、CD86、MHCⅡ的特異性引物進(jìn)行實時定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后應(yīng)用相對定量計算公式2-ΔΔCT計算對照組、移植A組及B組中各因子的表達(dá)比率。結(jié)果顯示，與對照組相比，移植A組及B組移植物中IL-12、IFN-γ、TNF-α和CD11c、CD80、CD86、MHCⅡ的表達(dá)明顯升高(P＜0.0