前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌分化與化療耐藥的關(guān)系研究.pdf

1、本課題擬先在組織學(xué)水平，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究NSE，P-gp，MRP1和Bcl-2在前列腺癌和良性前列腺增生癥(BPH)手術(shù)標(biāo)本中的表達(dá)。再在體外培養(yǎng)雄激素非依賴的前列腺癌DtJl45細(xì)胞，加入EGF和TGF-α誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生NED，并通過光鏡、電鏡觀察和檢測NSE在mRNA和蛋白水平證實(shí)。然后用不同濃度梯度的順鉑作用于誘導(dǎo)發(fā)生NED的和未誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞，并進(jìn)行對比研究。以期達(dá)到明確EGF和TGF-α是否可誘導(dǎo)NED,以及

2、NED是否可以介導(dǎo)前列腺癌化療耐藥的目的。 第一章前列腺癌和BPH組織中NSE、P-gp、MRPl和Bcl-2的表達(dá) 目的：探討NSE、P-gp、MRPl和Bcl-2在前列腺癌和BPH中的表達(dá)情況，并且研究這四種蛋白與前列腺癌分化程度的關(guān)系，從而為后續(xù)研究打下一定基礎(chǔ)。 材料和方法：10例BPH標(biāo)本(55-75歲，平均61.2歲)和44例前列腺癌標(biāo)本(61-77歲，平均64.3歲)取自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院泌尿外科20

3、00-2007年的手術(shù)標(biāo)本存檔蠟塊，標(biāo)本系10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。前列腺癌標(biāo)本按照Gleason評分。前列腺癌患者術(shù)前均未接受內(nèi)分泌治療或其他治療。標(biāo)本4grn厚連續(xù)切片，分別做NSE、P-gp、MRPl和Bcl-2免疫組化染色。觀察染色切片并計(jì)數(shù)10個(gè)具有代表性的高倍鏡視野中陽性細(xì)胞的數(shù)量。陽性細(xì)胞數(shù)≤5％者為陰性表達(dá)，>5％者為陽性表達(dá)。 結(jié)果：P-gp在前列腺癌和BPH組織中均無表達(dá)；NSE、MRPl和Bcl-2

4、均有表達(dá)。MRP1在兩種組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，前列腺癌中的表達(dá)高于BPH；NSE和Bcl-2的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。NSE、MRPl和Bcl-2的表達(dá)均隨著前列腺癌分化程度的降低而表達(dá)增高。NSE列聯(lián)系數(shù)(P)：0.458；MRP1列聯(lián)系數(shù)(P)：0.472；Bcl-2列聯(lián)系數(shù)(P)：0.375。將前列腺癌標(biāo)本按有無NSE表達(dá)分為兩組，MRPl和Bcl-2的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，且在NSE

5、表達(dá)陽性的前列腺癌組織中，兩種蛋白的表達(dá)均高于表達(dá)陰性的組織。 結(jié)論： (1)前列腺癌可表達(dá)NSE、MRPl和Bcl-2，且表達(dá)陽性率與腫瘤分化程度、Gleason評分相關(guān)，即分化差者表達(dá)更高。本研究未發(fā)現(xiàn)該腫瘤有P-gp陽性表達(dá)。 (2)表達(dá)NSE的前列腺癌，有更高的MRPl和Bcl-2表達(dá)率，即該腫瘤的NED與其MDR和抗凋亡能力增強(qiáng)有關(guān)。 (3)BPH可表達(dá)NSE、MRPl和Bcl-2，提示NED和

6、MRPl、Bcl-2的表達(dá)參與了該疾病的發(fā)生發(fā)展。 第二章雄激素非依賴前列腺癌細(xì)胞株DU145的NED誘導(dǎo)及P-gp、MRPl和Bcl-2變化檢測 目的：探討DU145細(xì)胞在受.EGF和TGF-a作用后是否會(huì)促進(jìn)NED，并且檢測P-gp、MRPl和Bcl-2的蛋白表達(dá)情況。 材料和方法：將DU145細(xì)胞在不同條件下培養(yǎng)三天，每日光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。收集三天后的細(xì)胞，Western印跡雜交檢測NSE、P-gp

7、、MRPl和Bcl-2的表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光半定量RT-PCR檢測NSEmRNA的表達(dá)，電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒。 結(jié)果：(1)光鏡下觀察：2％BCS不加生長因子的培養(yǎng)環(huán)境下，每天細(xì)胞形態(tài)無明顯變化；加入10ng/ml EGF培養(yǎng)者較5ng/ml者形態(tài)學(xué)變化明顯，以第一天發(fā)生NED的細(xì)胞數(shù)最多，每天逐漸增多，至第三天時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變化更加明顯，表現(xiàn)為胞體由原來的橢圓形向三角形、多邊形轉(zhuǎn)化，細(xì)胞伸出神經(jīng)突出樣突起；TGF-a誘導(dǎo)的

8、細(xì)胞數(shù)目與EGF相似，但形態(tài)學(xué)變化不如EGF明顯。加入AG825(EGFR的酪氨酸激酶抑制劑)的培養(yǎng)細(xì)胞，形態(tài)無明顯變化。 (2)Western印跡雜交結(jié)果：NSE的表達(dá)：在不加生長因子的2％BCS細(xì)胞中表達(dá)很弱，經(jīng)EGF誘導(dǎo)后表達(dá)明顯增強(qiáng)，且10ng/ml強(qiáng)于5ng/ml，而加入AG825拮抗EGF作用者，幾乎無NSE表達(dá)。經(jīng)TGF-a誘導(dǎo)后的效果與EGF相近。Bcl-2的表達(dá)：在不加生長因子的2％細(xì)胞有表達(dá)，經(jīng)EGF或TGF

9、-a誘導(dǎo)后表達(dá)明顯增強(qiáng)，加入AG825拮抗。EGF作用者表達(dá)較弱。P-gp的表達(dá)：各組細(xì)胞幾乎無表達(dá)。MRPl的表達(dá)：在不加生長因子的2％細(xì)胞有表達(dá)，經(jīng)EGF或TGF-a誘導(dǎo)后表達(dá)明顯增強(qiáng)，加入AG825拮抗EGF和TGF-a作用者幾乎無表達(dá)。 (3)實(shí)時(shí)熒光半定量RT-PCR：相對于只加入2％BCS培養(yǎng)基的而言，加入EGF 10 ng/ml和TGF-a 10 ng/ml的細(xì)胞的NSE mRNA分別增加10.7和10.1倍，提示

10、NED程度增加。而加入AG825拮抗劑者則表達(dá)分別下降81％和77％。 (4)電鏡觀察：在不加生長因子的2％BCS細(xì)胞中幾乎無神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒，經(jīng)EGF和TGF-α誘導(dǎo)后，顆粒明顯增多，而加入AG825拮抗者，幾乎無神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒。 結(jié)論： (1)EGF和TGF-α可誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞發(fā)生NED，其誘導(dǎo)作用可被AG825所拮抗。 (2)DU145細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)NSE、MRPl和Bcl-2增強(qiáng)，提示

11、抗凋亡性和耐藥性增強(qiáng)。 第三章 NED誘導(dǎo)后DU145細(xì)胞對順鉑的耐藥性研究 目的：探討NED誘導(dǎo)后的前列腺癌DU145細(xì)胞的順鉑耐藥性變化。 材料和方法：EGF和TGF-a誘導(dǎo)DUl45細(xì)胞發(fā)生NED后，取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上。每組均加入不同濃度的順鉑(0.1，0.5，1，5，10，50，100μg/ml)。培養(yǎng)48小時(shí)后行MTT比色法檢測順鉑對各組DUl45細(xì)胞增殖的影響。同樣方法誘導(dǎo)后，取對

12、數(shù)生長期的不同分組DUl45細(xì)胞，加入濃度為μg/ml的順鉑，作用48小時(shí)后收集各組細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化離心后制成細(xì)胞懸液，行流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞百分率并行細(xì)胞周期分析。 結(jié)果：(1)順鉑可抑制DU145細(xì)胞的增殖。在各濃度點(diǎn)上，尤其在較高的順鉑濃度點(diǎn)上，經(jīng)EGF 10 ng/ml處理的細(xì)胞存活率大于EGF 5ng/ml，經(jīng)TGF-a10 ng/ml處理的細(xì)胞存活率大于TGF-a 5 ng/ml，相同濃度生長因子處理后的細(xì)胞，經(jīng)相

13、同濃度順鉑作用后細(xì)胞存活率相近。加入AG825拮抗生長因子作用者，細(xì)胞存活率明顯降低。 (2)濃度為5μg/ml的順鉑作用48小時(shí)后，經(jīng)生長因子誘導(dǎo)過的細(xì)胞凋亡率低，且EGF 10 ng/ml低于EGF 5 ng/ml(p<0.05)，TGF-a10ng/ml低于TGF-α5 ng/ml(p<0.05)；細(xì)胞周期也發(fā)生變化，G0/G1細(xì)胞數(shù)減少，S期和G2/M期細(xì)胞相應(yīng)增多。 結(jié)論：(1)EGF和TGF-α誘導(dǎo)前列腺癌D