環(huán)氧合酶-2抑制劑預(yù)防乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥發(fā)生的研究.pdf

1、目的：1．應(yīng)用化療藥物阿霉素(doxorubicin，Doxo)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7獲得性多藥耐藥發(fā)生，以此耐藥誘導(dǎo)模型為基礎(chǔ)將選擇性環(huán)氧合酶-2(COX-2)抑制劑塞來昔布(celecoxib)與耐藥誘導(dǎo)劑量的阿霉素聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞，檢測耐藥相關(guān)基因及蛋白的變化，探討塞來昔布對阿霉素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞多藥耐藥發(fā)生的預(yù)防作用。2．聯(lián)合應(yīng)用塞來昔布及阿霉素，探討塞來昔布對阿霉素細(xì)胞毒效應(yīng)的增敏作用。3．從MDR1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控

2、入手，檢測相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在基因、蛋白水平的變化及其與DNA的結(jié)合活性，探討塞來昔布下調(diào)阿霉素誘導(dǎo)MDR1過表達(dá)的機(jī)制。 方法：1．四唑藍(lán)(MTT)比色法：檢測不同濃度阿霉素對MCF-7細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)，尋找適宜的阿霉素濃度及作用時(shí)間進(jìn)行耐藥誘導(dǎo)；聯(lián)合應(yīng)用阿霉素及低濃度的塞來昔布(無明顯細(xì)胞生長抑制效應(yīng))，計(jì)算阿霉素對MCF-7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，分析塞來昔布對阿霉素細(xì)胞毒效應(yīng)的增敏作用。2．逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT—

3、PCR)檢測MDR1、MRP1、topoⅡ、GST、NF．KB、c—Jun及YB-1等基因的mRNA表達(dá)水平。3．流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測細(xì)胞膜P—糖蛋白(P—gp)表達(dá)水平。4．細(xì)胞內(nèi)羅丹明123(Rh0123)潴留實(shí)驗(yàn)分析P—gp的功能狀態(tài)。5．免疫印跡反應(yīng)(Westernblot法)檢測MRP1、NF—κB、c—iun及YB-1蛋白表達(dá)水平。6．凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)(EMSA)方法檢測轉(zhuǎn)錄因子NF—κB及A

4、P-1與DNA的結(jié)合活性。7．FCM檢測阿霉素、塞來昔布單獨(dú)作用及聯(lián)合應(yīng)用對MCF-7細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果：1．MTT結(jié)果顯示：阿霉素0.05ug/ml作用于MCF-7細(xì)胞，3d后生長受抑制，7d后生長抑制效應(yīng)明顯減弱，生長抑制率分別為23.70％及9.03％；但在0.5ug/ml的濃度作用下，3d后生長抑制效應(yīng)明顯，7d后抑制效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)，生長抑制率分別為60％及72.90％；此表明，阿霉素0.05ug/ml作用7d，可誘

5、導(dǎo)MCF-7細(xì)胞耐藥發(fā)生。2．阿霉素0.05ug/ml處理MCF-7細(xì)胞7d與末處理組相比：RT—PCR發(fā)現(xiàn)MDR1及MRP1在mRNA水平上調(diào)(P＜0.01)；TopoⅡ及GST在mRNA水平差異性不顯著(P＞0.05)；Western—blot發(fā)現(xiàn)MRP1蛋白表達(dá)與其mRNA表達(dá)水平相一致；FCM顯示細(xì)胞膜P—gp表達(dá)上調(diào)，熒光強(qiáng)度為32.66±2.49，而未處理組為4.67_+0.49(P＜0.01)。3．與阿霉素0.05ug/m

6、l組相比，阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布(10uM，20uM)處理7d，MDR1、MRP1在mRNA水平下調(diào)(P＜0.01)；其蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)變化相一致；細(xì)胞膜P—gp熒光強(qiáng)度分別為6.41±0.71及5.55±0.50，而阿霉素0.05ug/ml組為32.66±2.49，差異性顯著(P＜0.01)。4．阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布(10uM，20uM)處理7d，細(xì)胞內(nèi)Rh123的熒光強(qiáng)度明顯增加，分別為373.0

7、3±15.41及341.44±11.75，與阿霉素單用組72.77±8.88相比，差異性顯著(P＜0.0105．阿霉素0.05ug/ml組與未處理組相比，轉(zhuǎn)錄因子YB-1、NF—κB和c—Jun在mRNA及蛋白水平均上調(diào)；阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布10uM組與阿霉素0.05ug/ml組相比，YB-1、NF—κB和c—Jun在mRNA及蛋白水平均下調(diào)。6．阿霉素0.05ug/ml組與未處理組相比，轉(zhuǎn)錄因子NF—κB和AP-1的活

8、性明顯增高；阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布10uM組與阿霉素0.05ug/ml組相比，NF—κB和AP-1的活性均明顯降低。7．阿霉素聯(lián)合塞來昔布10uM作用48h后，可顯著抑制MCF-7細(xì)胞的生長，IC50為(0.38±0.04)ug/ml，而阿霉素單用的IC50為(0.67±0.03)ug/ml(P＜0.01)。8．與未處理組相比，阿霉素0.05ug/ml組及阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布10uM組，G0+G1期細(xì)胞比率

9、均增加(P＜0.01)，S期細(xì)胞比率均減少(P＜0.01)；塞來昔布10uM單獨(dú)作用組G0+G1期及S期細(xì)胞比率無顯著差異性(P＜0.05)；與阿霉素0.05ug/ml組相比，阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布10uM組G0+G1期細(xì)胞比率增加(P＜0.01)，S期細(xì)胞比率減少(P＜0.01)；G2+M期細(xì)胞比率在各組間均無顯著差異(P＞0.05)。 結(jié)論：1．阿霉素0.05ug/ml作用于MCF-7細(xì)胞7d可成功誘導(dǎo)多藥耐藥

10、發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)MDR1、MRP1在mRNA及蛋白水平均上調(diào)。2．在MCF-7細(xì)胞中，塞來昔布可有效干預(yù)阿霉素誘導(dǎo)的MDR1、MRP1過表達(dá)，預(yù)防多藥耐藥的發(fā)生。3．塞來昔布下調(diào)MDR1基因表達(dá)與抑制轉(zhuǎn)錄因子YB-1、NF—κB和AP-1的表達(dá)及活性相關(guān)。4．塞來昔布對阿霉素的細(xì)胞毒效應(yīng)有明顯的增敏作用，可將MCF-7細(xì)胞阻滯于G0+G1期。 綜上所述，環(huán)氧合酶-2抑制劑塞來昔布可通過多種機(jī)制預(yù)防乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥的發(fā)生，為臨床腫瘤