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文檔簡介
1、第一部分Notch信號通路基因在人腦動靜脈畸形和周圍腦組織中的差異表達(dá)
目的:應(yīng)用基因芯片研究人腦動靜脈畸形(brain arteriovenousmal format ions,BAVM)畸形團(tuán)及周圍腦組織的Notch信號通路相關(guān)基因的差異表達(dá)。
方法:收集有出血史的5例腦動靜脈畸形,在畸形團(tuán)、周圍腦組織分別取材,進(jìn)行Notch信號通路基因芯片雜交,得到基因芯片上各基因點(diǎn)數(shù)值型信號強(qiáng)度,計(jì)算其均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。計(jì)算畸形
2、團(tuán)芯片及周圍腦組織芯片上各基因點(diǎn)的比值。取比值大于1.5或小于0.67的因子,歸納總結(jié)出表達(dá)水平有明顯差異的基因。以realtime PCR方法對其中任意選取的2個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。
結(jié)果:在113個(gè)Notch信號通路基因中,共篩選出27個(gè)明顯變化的基因,其中,上調(diào)的4個(gè),下調(diào)的23個(gè)。較為重要的基因包括:Notch信號通路配體DLL1、DLL3,受體及配體裂解關(guān)鍵基因ADAM10、ADAM17,Notch信號通路靶基因HES5,
3、Notch相關(guān)的Sonic Hedgehog通路基因GLI1、Wnt信號通路基因FZD1、原癌基因LM02。realtime PCR驗(yàn)證DLL1和HES5兩個(gè)基因,其檢測結(jié)果與芯片結(jié)果基本相符。部分Notch信號通路關(guān)鍵基因在兩個(gè)部位表達(dá)無差異。
結(jié)論:多個(gè)Notch信號通路基因在BAVM畸形團(tuán)及周圍腦組織存在差異表達(dá),提示BAVM的發(fā)生發(fā)展與Notch信號通路有關(guān)。周圍腦組織中,Notch信號通路亦可能存在異常。差異表達(dá)的基
4、因可作為BAVM進(jìn)一步研究的切入點(diǎn)。
第二部分新型鈉鈣交換蛋白NCEx等在大鼠腦出血模型中的表達(dá)變化
目的:觀察新型鈉鈣交換蛋白NCEx、糖代謝相關(guān)蛋白—1(glucose metabolismrelated protein—1,GMRP-1)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、Notch信號通路相關(guān)基因在大鼠腦出血模型中的表達(dá)變化,初步探討細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、NCEx與Notch信號通路的關(guān)系。
方法:建立大鼠自發(fā)性腦出血
5、模型(EICH)后,進(jìn)行四部分實(shí)驗(yàn)。1、realtime PCR法、Western blot法檢測造模后6h、1天、3天、5天、7天各時(shí)間點(diǎn)出血側(cè)及對側(cè)尾狀核、對照組右側(cè)尾狀核NCEx mRNA及蛋白表達(dá)水平;免疫組化法分析造模后6h、3天、7天各時(shí)間點(diǎn)出血側(cè)及對側(cè)尾狀核、對照組右側(cè)尾狀核NCEx表達(dá)的形態(tài)學(xué)。2、Western blot法檢測造模后6h、1天、3天、5天、7天各時(shí)間點(diǎn)出血側(cè)及對側(cè)尾狀核、對照組右側(cè)尾狀核GMRP-1蛋白
6、表達(dá)水平。3、Fura—2/AM負(fù)載雙波長熒光分光光度計(jì)法檢測造模后6h、1天、3天、5天、7天出血側(cè)及對照組右側(cè)尾狀核細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。4、realtime PCR法測定造模后6h、3天、7天各時(shí)間點(diǎn)出血側(cè)及對照組右側(cè)尾狀核Notch4和ADAM10 mRNA表達(dá)水平。
結(jié)果:1、正常情況下,NCEx mRNA在大鼠尾狀核有一定量表達(dá)。在自發(fā)性腦出血模型造模后6小時(shí),NCEx mRNA表達(dá)水平即下降;至造模后3天,其表達(dá)水平
7、降至最低;造模后7天,表達(dá)水平回復(fù)至正常水平。造模后每個(gè)時(shí)間點(diǎn),出血側(cè)NCExmRNA的表達(dá)水平,都低于未出血側(cè)。造模后3天時(shí),與對側(cè)相比,NCEx基因表達(dá)下降3倍。Western blot的結(jié)果與realtime PCR法檢測結(jié)果相符。免疫組化顯示自發(fā)性腦出血模型造模后各時(shí)間點(diǎn),NCEx的染色都較正常組染色淺,且稀疏。染色最淺及稀疏的是造模后6h。造模后每個(gè)時(shí)間點(diǎn),同對側(cè)相比,NCEx的染色都較淺及稀疏。2、GMRP-1蛋白在正常大鼠
8、尾狀核有一定量表達(dá)。自發(fā)性腦出血模型造模后6小時(shí),GMRP-1蛋白表達(dá)水平即下降;造模后第1至5天表達(dá)水平降至最低;造模后7天,表達(dá)水平復(fù)又升高。造模后各時(shí)間點(diǎn),出血側(cè)GMRP-1蛋白的表達(dá)水平都低于對側(cè);造模后第7天的表達(dá)水平同對側(cè)的差別無統(tǒng)計(jì)意義。造模后1天時(shí),與對側(cè)相比,GMRP-1表達(dá)下降4倍左右。3、測得正常情況下尾狀核細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度為(277.1±22.0)nmol/L。造模后6小時(shí),胞內(nèi)鈣離子濃度即升高;造模后第3天,胞
9、內(nèi)鈣離子濃度水平達(dá)(887.5±52.2) nmol/L,為正常值的3倍余;此后,水平開始下降。胞內(nèi)鈣離子濃度和NCEx蛋白表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)r=0.66(P<0.05)。4、正常情況下,ADAM10 mRNA及Notch4 mRNA在大鼠尾狀核有一定量表達(dá)。在自發(fā)性腦出血模型造模后6小時(shí),兩者的表達(dá)水平即降至最低;造模后3天,表達(dá)水平開始升高;造模后7天,表達(dá)量高于正常水平。
結(jié)論:調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度的NCEx、調(diào)控細(xì)胞凋亡與
10、增殖的GMRP-1、調(diào)控細(xì)胞及組織新生、分化與重構(gòu)的Notch信號通路因子Notch4和ADAM10在腦出血后呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律。NCEx的表達(dá)水平和胞內(nèi)鈣離子濃度相關(guān)。NCEx、GMRP-1、Notch信號通路的動態(tài)表達(dá)水平,表明三者可能參與腦出血后早期鈣超載引起的細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞的凋亡及后期細(xì)胞與組織的新生、增殖與重構(gòu)。
第三部分NCEx在缺氧培養(yǎng)人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)研究
目的:通過研究缺氧培養(yǎng)的人腦血管內(nèi)皮
11、細(xì)胞(Human brain vascularendothelial cells,HBVEC)中NCEx的異常表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測定,初步探索缺氧、NCEx、胞內(nèi)鈣離子濃度和血管內(nèi)皮功能異常之間的關(guān)系。
方法:復(fù)蘇HBVEC并傳代培養(yǎng)后,將細(xì)胞分為缺氧培養(yǎng)組及正常培養(yǎng)組,前者置于無氧培養(yǎng)箱中以普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí),后者以普通培養(yǎng)條件培養(yǎng)。分別以Western blot法檢測NCEx蛋白含量和Fura—2/AM負(fù)載雙波長熒
12、光分光光度計(jì)法檢測胞內(nèi)鈣離子濃度。
結(jié)果:HBVEC成功復(fù)蘇并傳代。缺氧培養(yǎng)24小時(shí),HBVEC漂浮死亡的細(xì)胞較少。正常培養(yǎng)的HBVEC表達(dá)一定量的NCEx;缺氧培養(yǎng)24h后,HBVEC的NCEx表達(dá)明顯降低,為正常情況下表達(dá)量的0.16倍。缺氧培養(yǎng)24h后,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高至2.2倍。
結(jié)論:普通培養(yǎng)液無氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h制作內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷模型切實(shí)可靠。缺氧可使HBVEC的NCEx mRNA表達(dá)下調(diào),并使胞
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