小鼠膿毒癥繼發(fā)AKI模型的制備以及炎癥介質(zhì)的變化和作用.pdf

1、目的:膿毒癥是重癥患者的主要死因之一,且發(fā)生率還在不斷增長(zhǎng)。在過(guò)去的十年中,住院患者的重癥膿毒癥發(fā)病率將近翻了一倍,大大超出了先前的預(yù)計(jì)。膿毒癥可以導(dǎo)致許多器官功能障礙,其中就包括急性腎損傷。在ICU中AKI的發(fā)病率為6％,其中由膿毒癥導(dǎo)致的約為50％,還有一些研究指出這個(gè)比例約為45％～70％。并且,由膿毒癥導(dǎo)致AKI的患者預(yù)后很差,死亡率高達(dá)70％。就目前的研究而言,炎癥反應(yīng)在缺血再灌注導(dǎo)致AKI發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制中,扮演了及其重

2、要的角色。但在腹腔感染膿毒癥所致AKI中,炎癥因子到底是否也起到了重要的作用,其器官損傷是否和宿主的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)我們還不甚了解。
　　 本研究探旨在探討建立更加貼近臨床的小鼠膿毒癥繼發(fā)急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)模型以及觀察在急性腎損傷時(shí)炎癥介質(zhì)的變化及作用。
　　 方法:本研究利用改進(jìn)的更加貼近臨床的盲腸結(jié)扎穿孔(CecalLigation and Puncture,CLP)法復(fù)制小

3、鼠膿毒癥致AKI模型。選取健康雄性C57BL/6小鼠60只,隨機(jī)分為3組,①空白對(duì)照組(Normal group)12只:不給予任何處理,通過(guò)取眼球法采血,隨后直接處死;②假手術(shù)組(Sham group)24只:只開(kāi)腹,翻動(dòng)腸管,牽拉盲腸,關(guān)腹,不結(jié)扎和穿孔盲腸;③盲腸結(jié)扎穿孔組(CLP group)24只:進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)。假手術(shù)組(Sham group)與盲腸結(jié)扎穿孔組(CLP group),術(shù)后37℃“生理鹽水”30ml/kg股

4、部皮下注射,并于術(shù)后3小時(shí)“亞胺培南西司他丁鈉”25mg/kg+NS1.0ml,腹部皮下注射,Q12hr×2天。假手術(shù)組(Sham group)與盲腸結(jié)扎穿孔組(CLP group)分別在術(shù)后6 h、12 h、24 h后通過(guò)取眼球法采血(每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各8只),空白對(duì)照組(Normal group),直接取血,各組取的血標(biāo)本離心后取血清于-80℃凍存,用ELISA法測(cè)定血清中的肌酐、尿素氮、IL-1、IL-6、TNF-α水平,取腹水做細(xì)

5、菌定量培養(yǎng),并取出腎臟,放入10％中性福爾馬林中,固定24至48小時(shí),石蠟包被,供光鏡檢測(cè)備用,隨即處死取血后的小鼠。
　　 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0版軟件包(SPSS Company,Chicago,Illinois,USA)進(jìn)行;數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組均數(shù)的比較行兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析,多個(gè)均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義。
　　 結(jié)果:
　　 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況的觀察
　　 假手術(shù)組小鼠術(shù)后清醒較快,活動(dòng)靈活,自由飲水,剖腹見(jiàn)少量腹水,無(wú)惡臭。盲腸結(jié)扎穿孔組動(dòng)物術(shù)后蘇醒延遲,精神萎靡,活動(dòng)遲緩,精神較差,豎毛,呼吸急促,剖腹可見(jiàn)淡血性腹水多,惡臭,腸管水腫,有的盲腸末端發(fā)黑。
　　 2各組小鼠腎臟大體形態(tài)觀察和組織病理變化(HE染色)及腎臟組織損傷病理評(píng)分結(jié)果
　　 CLP組小鼠腎臟可見(jiàn)充血明顯而假手術(shù)組和正常

7、對(duì)照組小鼠的腎臟形態(tài)無(wú)明顯異常。
　　 腎臟組織病理變化(HE染色):空白對(duì)照組:腎臟組織正常表現(xiàn);假手術(shù)組:腎小管上皮細(xì)胞無(wú)腫脹及變性,形態(tài)正常。盲腸結(jié)扎穿孔組可觀察到腎小球及腎小管充血明顯,腎小管上皮細(xì)胞體積增大,胞漿呈嗜酸性顆粒狀以及有空泡變性出現(xiàn)。
　　 腎臟組織損傷病理評(píng)分結(jié)果:術(shù)后6、12、24小時(shí)的評(píng)分CLP組均高于假手術(shù)組(P＜0.05);CLP組術(shù)后6、12、24小時(shí)的評(píng)分相比變化并不明顯(P＞0.05

8、)相同的結(jié)果也出現(xiàn)在假手術(shù)組(P＞0.05)。
　　 3各組小鼠腹水的性質(zhì)以及細(xì)菌定量測(cè)定結(jié)果
　　 正常對(duì)照組及假手術(shù)組剖腹見(jiàn)少量腹水,無(wú)惡臭,盲腸結(jié)扎穿孔組小鼠剖腹可見(jiàn)淡血性腹水多,惡臭。
　　 CLP組小鼠,術(shù)后6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)腹水細(xì)菌定量結(jié)果均為大于105cfu/ml;假手術(shù)組和正常對(duì)照組的腹水中均未找到致病微生物存在的證據(jù)。
　　 4各組小鼠血清肌酐含量的比較
　　 術(shù)后6小時(shí)

9、,CLP組的血清肌酐值明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)與正常對(duì)照組(P＜0.05);術(shù)后12、24小時(shí)CLP組的血清肌酐值與假手術(shù)組(P＞0.05)與正常對(duì)照組(P＞0.05)之間沒(méi)有明顯差別;術(shù)后6、12、24小時(shí)假手術(shù)組與正常對(duì)照組之間沒(méi)有明顯差別(P＞0.05);CLP組術(shù)后6小時(shí)、12小時(shí)與24小時(shí)的血清肌酐含量相比較,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比較無(wú)明顯差別(P＞0.05)。
　　 5各組小鼠血清尿素氮含量的比較
　　 術(shù)后

10、6、12、24小時(shí)CLP組的血清尿素氮均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)與正常對(duì)照組(P＜0.05),假手術(shù)組與正常對(duì)照組之間沒(méi)有明顯差別(P＞0.05);CLP組術(shù)后6小時(shí)、12小時(shí)與24小時(shí)的血清尿素氮相比較,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比較無(wú)明顯差別(P＞0.05),但各組均高于相對(duì)于正常對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 6各組小鼠血清IL-1含量的比較
　　 術(shù)后6、12、24小時(shí)CLP組的血清IL-1含量均明顯高于假手術(shù)組(P＜

11、0.05)與正常對(duì)照組(P＜0.05),假手術(shù)組與正常對(duì)照組之間沒(méi)有明顯差別(P＞0.05);CLP組CLP術(shù)后6小時(shí)、12小時(shí)與24小時(shí)的血清IL-1含量相比較,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比較無(wú)明顯差別(P＞0.05)。
　　 7各組小鼠血清IL-6含量的比較
　　 術(shù)后6、12、24小時(shí)CLP組的血清IL-6含量均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.001)與正常對(duì)照組(P＜0.001),假手術(shù)組與正常對(duì)照組之間沒(méi)有明顯差別(P＞0.05)

12、;CLP組CLP術(shù)后6小時(shí)的血清IL-6含量高于術(shù)后24小時(shí)的含量(P=0.049);術(shù)后12小時(shí)分別與術(shù)后6小時(shí)、24小時(shí)相比較無(wú)明顯差別(P＞0.05),與正常對(duì)照組相比均有明顯區(qū)別(P＜0.005)。
　　 8各組小鼠血清TNF-α,含量的比較
　　 術(shù)后6、12、24小時(shí)CLP組的血清TNF-α含量均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.001)與正常對(duì)照組(P＜0.001),假手術(shù)組與正常對(duì)照組之間沒(méi)有明顯差別(P＞0.0

13、5);CLP組術(shù)后6小時(shí)、12小時(shí)與24小時(shí)的血清TNF-α含量相比較,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比較無(wú)明顯差別(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的更加貼近臨床的CLP法可成功復(fù)制由腹腔感染膿毒癥繼發(fā)AKI的小鼠動(dòng)物模型。
　　 2 CLP術(shù)后血清IL-1、IL-6、TNF-α、肌酐、BUN的含量均增高(P＜0.05)且腎臟組織病理?yè)p傷評(píng)分也較假手術(shù)組有意義(P＜0.05),所以炎癥介質(zhì)釋放可能是膿毒癥繼