轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1與腫瘤微環(huán)境誘導的上皮細胞間質(zhì)化相關性研究.pdf

1、轉(zhuǎn)移是腫瘤的惡性標志之一，也是導致臨床治療失敗和患者死亡的最主要原因。nm23-H1基因是人類發(fā)現(xiàn)的第一個腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的機制十分復雜，許多機制目前尚未闡清。上皮細胞間質(zhì)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮性腫瘤細胞獲得侵潤和遷徙能力的重要方式。目前還沒有關于腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1與EMT之間相關性的報道。一些間接的證據(jù)顯示nm23-H1與EMT之間存在著一

2、定的聯(lián)系。為了進一步闡述nm23-H1抑制腫瘤的分子機制，為尋找腫瘤轉(zhuǎn)移治療新的靶點，我們對于nm23-H1基因與腫瘤細胞上皮細胞間質(zhì)化的相關性進行了研究，并對nm23-H1發(fā)揮作用的可能的信號傳導通路進行了探討。
　　 第一部分腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1對于肺腺癌細胞上皮細胞間質(zhì)化的影響
　　 目的:研究轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1對于肺腺癌細胞系A549以及A549-99上皮細胞間質(zhì)化的影響。
　　 方法:

3、我們應用EMT誘導劑刺激細胞，使其發(fā)生EMT。應用nm23-H1 siRNA和含有nm23-H1 cDNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)nm23-H1基因的表達水平，研究nm23-H1基因?qū)τ谀[瘤細胞EMT的影響。通過觀察形態(tài)學的變化確認nm23-H1基因?qū)τ贓MT表型的影響;用劃痕實驗檢測細胞的遷徙能力的變化;通過小室檢測細胞侵襲能力的變化。應用western blot和免疫熒光的方法來檢測EMT標志物蛋白水平表達的變化，應用Real-time PC

4、R檢測了EMT標志物mRNA水平的變化。我們還通過流式細胞儀檢測了肺癌干細胞標志物以及細胞周期的改變。
　　 結果:細胞經(jīng)過TGF-β1誘導后，細胞形態(tài)由多角形的典型上皮細胞形態(tài)轉(zhuǎn)化成為紡錘形的間質(zhì)細胞形態(tài)，細胞的遷移能力、侵襲能力增強。上皮細胞標志物E-cadherin蛋白和mRNA水平表達降低，間質(zhì)細胞標志物β-catenin和fibronectin蛋白和mRNA水平表達增加。其他的EMT誘導劑如HGF、IL-6、血清等對于

5、EMT標志物影響的結果相似，但不如TGF-β1明顯。細胞nm23-H1基因沉默后，細胞經(jīng)過相同條件的TGF-β1誘導EMT，細胞更易與獲得間質(zhì)細胞的特征。表現(xiàn)為紡錘形的間質(zhì)細胞形態(tài)更加明顯，細胞的遷移能力、侵襲能力增強。上皮細胞標志物E-cadherin蛋白和mRNA水平表達降低，間質(zhì)細胞標志物β-catenin和fibronectin蛋白和mRNA水平表達增加，并同時獲得某些肺癌干細胞的特征。對于細胞周期的影響不是十分明顯。而當nm2

6、3-H1基因過表達或恢復表達后，則可以一定程度上逆轉(zhuǎn)細胞EMT標志物的表達。
　　 結論:腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1可以通過抑制腫瘤EMT的發(fā)生來發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。
　　 第二部分腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1通過轉(zhuǎn)錄因子snail抑制肺腺癌細胞上皮細胞間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化
　　 目的:轉(zhuǎn)錄因子snail在調(diào)節(jié)EMT當中起到關鍵作用。研究轉(zhuǎn)錄因子snail是否對于腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1抑制肺腺癌細胞上皮

7、細胞間質(zhì)化的過程。
　　 方法:應用western blot分別檢測了nm23-H1沉默與過表達之后snail蛋白水平表達的變化，用Real-time PCR檢測了nm23-H1基因沉默后mRNA水平的變化，應用雙報告基因的方法研究了snail啟動子的活性變化。其次應用snail siRNA和含有snail cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，確定snail是否影響nm23-H1基因?qū)τ贓MT的抑制作用。通過westem blot檢測了EMT

8、標志物蛋白的表達變化。
　　 結果:轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1沉默后，TGF-β誘導細胞EMT，轉(zhuǎn)錄因子snail在蛋白和mRNA水平表達增加，啟動子活性增高。當nm23-H1過表達后，轉(zhuǎn)錄因子snail蛋白的表達水平減低。轉(zhuǎn)錄因子snail基因沉默后，只能部分逆轉(zhuǎn)nm23-H1沉默后細胞EMT后蛋白標志物的變化;而當轉(zhuǎn)染snail cDNA后，nm23-H1沉默對于某些間質(zhì)標志物仍然有促進作用。顯示出nm23-H1可以部分通過

9、轉(zhuǎn)錄因子snail來發(fā)揮其抑制EMT的作用，但還可能通過其他的機制抑制腫瘤細胞EMT的發(fā)生。
　　 結論:腫瘤抑制基因nm23-H1可以部分通過轉(zhuǎn)錄因子snail抑制腫瘤EMT的發(fā)生，進而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，但是nm23-H1基因還可能通過其他因子來起作用。
　　 第三部分腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1抑制肺腺癌細胞上皮細胞間質(zhì)化信號通路的研究
　　 目的:研究細胞中信號傳導通路在介導腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1抑

10、制肺腺癌細胞上皮細胞間質(zhì)化中的作用，進一步揭示nm23-H1抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機制。
　　 方法:應用了影響EMT較為重要的信號通路的抑制劑，用來篩選相關的信號通路，并用western blot檢測了EMT標志物蛋白以及TGF-β和Src信號通路上的關鍵蛋白在應用抑制劑前后以及nm23-H1基因沉默前后表達的變化。我們還同時檢測了nm23-H1作用蛋白STRAP基因沉默后EMT標志物蛋白以及TGF-β信號通路上的關鍵蛋白表達的變化。

11、
　　 結果:nm23-H1基因沉默后，在相同的TGF-β1濃度下，TGF-β信號通路強度增加，Src蛋白的活性增加更明顯;nm23-H1過表達后能夠逆轉(zhuǎn)相關蛋白的表達。信號通路抑制劑的結果顯示，Src蛋白在nm23-H1基因抑制TGF-β誘導的EMT過程中發(fā)揮重要作用。此外，腫瘤抑制基因nm23-H1可以與STRAP協(xié)同作用抑制TGF-β1誘導的EMT。
　　 結論:腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1可以通過負向調(diào)節(jié)TGF