二氫楊梅素抑制致癌物誘導乳腺上皮細胞癌變與ATM基因甲基化的相關性研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,也是女性與癌癥相關死亡的首要原因。腫瘤的發(fā)生與原癌基因激活、抑癌基因沉默、DNA損傷修復缺陷等機制密切相關。某些抑癌基因在腫瘤發(fā)展過程中以各種不同的方式失活:如染色體的缺失,染色體插入或重排、單個堿基的突變或表觀遺傳改變如DNA甲基化。乳腺癌發(fā)生過程中相關基因異常的DNA甲基化破壞了基因的穩(wěn)定性,使其發(fā)生可遺傳的轉錄沉默。DNA甲基化在基因轉錄調控及細胞惡性轉化過程中的重要作用已被人們所認可。此外,異常

2、的DNA甲基化在腫瘤發(fā)生過程中往往是一個早期事件,甚至比一些可見的病變更早發(fā)生。大多數(shù)的生命活動都需要通過相應的酶來催化調控,DNA甲基化的狀態(tài)的改變也不例外,因此對調節(jié)DNA甲基化狀態(tài)的酶進行深入研究,對更好地了解DNA甲基化有重要意義。DNA甲基化是由DNA甲基轉移酶(DNMTs)催化和維持的,主要包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1的主要作用是通過將甲基化信息傳遞給子代細胞,保持DNA甲基化模式的延續(xù);而DNMT

3、3a和DNMT3b主要參與調節(jié)DNA從頭甲基化。
　　ATM( ataxia telangiectasia mutated gene)是共濟失調毛細血管擴張癥(ataxia telangiectasi,AT)的突變基因,作為DNA損傷反應系統(tǒng)的核心組成部份,常被認為是一種腫瘤抑制基因,同時也被證實與乳腺癌的易感性有一定相關性。有研究發(fā)現(xiàn),ATM基因啟動子區(qū)域的甲基化與包括乳腺癌在內的許多癌癥相關。由于甲基化是可逆的過程,可以通過去

4、甲基化作用從而恢復基因的表達和功能。大量研究證據(jù)表明環(huán)境致癌物的長期暴露與乳腺癌發(fā)生有著密切聯(lián)系,而致癌物誘導細胞DNA損傷是其致癌作用的重要病理基礎,因此研究ATM這一與DNA損傷修復緊密相關的基因在化學致癌物誘導乳腺細胞癌變過程的變化,對于揭示乳腺癌發(fā)生的機制以及探索乳腺癌的預防控制措施具有重要意義。
　　越來越多的研究表明,膳食中的一些天然化合物可以通過抑制DNA甲基轉移酶的活性而改變癌細胞中DNA甲基化狀態(tài),從而使甲基化沉

5、默的抑癌基因恢復表達。二氫楊梅素(Ampelopsin,AMP)是從藤茶等植物的莖葉中提取的一種二氫黃酮醇類化合物,是一種天然膳食成分,已被報道具有廣泛的生物和藥理活性,如抗炎、抗氧化、保肝、抗腫瘤等。但其抗癌作用的確切分子機制尚未明確,尤其是在腫瘤發(fā)生階段的作用研究較少。
　　基于以上分析,本研究采用人正常乳腺上皮細胞MCF-10A長期暴露于低劑量的煙草及環(huán)境致癌物NNK和B[a]P建立體外乳腺癌變細胞模型,研究AMP對乳腺腫瘤

6、發(fā)生階段的影響,并觀察ATM基因甲基化在乳腺癌變過程的變化及AMP的干預效應,以探討AMP影響乳腺癌發(fā)生的潛在表觀遺傳機制。
　　主要實驗結果和結論如下:
　　1.不同濃度(5_、10^M、20^M和40^M)AMP處理人乳腺癌MCF-7細胞48h后,采用CCK-8法檢測細胞活力,結果顯示5^M AMP處理對MCF-7細胞活力無顯著影響,但10^M、20^M和40^M AMP處理的細胞活力隨處理濃度的增高而顯著下降(P<0.

7、05),AMP的IC5Q約為20pM。
　　2.100pmol/L NNK和100pmol/L B[a]P的化學致癌物聯(lián)合反復處理正常乳腺上皮細胞MCF-10A,隨著處理周期數(shù)的增加,細胞逐步具有一些腫瘤細胞的生物學特性,具體表現(xiàn)為:生長因子的依賴性逐漸降低,錨定非依賴性生長能力和細胞劃痕愈合能力逐漸增強,DNA損傷程度加強(yH2AX焦點數(shù)量增加),而20pM AMP與致癌物聯(lián)合作用時,能夠抑制細胞發(fā)生上述細胞生物學特性的改變。

8、
　　3.在化學致癌物誘導的MCF-10A乳腺細胞癌變模型中,致癌物組處理10、15個周期(P10、P15)時,基因組整體DNA甲基化水平明顯降低(P〈0.05);而AMP與致癌物聯(lián)合處理組在整個致癌模型各時相點對基因組整體DNA甲基化水平無顯著性的影響。
　　4.致癌物處理組MCF-10A細胞的DNMT1酶活性及表達水平隨處理周期數(shù)的增加而顯著上升,20^M AMP與致癌物聯(lián)合處理組MCF-10A細胞的DNMT1酶活性及表

9、達水平則從P10起顯著下降。
　　5.計算機模擬分子對接結果顯示,AMP可能通過與DNMT1結構活性域特異性位點相結合,從而抑制其活性。
　　6.致癌物處理組MCF-10A細胞中ATM基因的表達水平明顯降低,而20^M AMP與致癌物聯(lián)合處理組ATM基因的表達水平則明顯升高,且相應的變化具有時間依賴效應。然而,與ATM相關的CHK2、RAD51和p53基因的表達水平在致癌物處理組細胞中無明顯改變,在AMP和致癌物聯(lián)合處理組則

10、隨處理代數(shù)增加而表達增強。
　　7.MSP檢測結果顯示,在致癌物處理的MCF-10A細胞中,隨處理周期數(shù)增加,ATM基因甲基化條帶(M條帶)亮度逐漸變強,非甲基化條帶(U條帶)亮度逐漸減弱,提示致癌物使ATM基因啟動子發(fā)生了一定程度的甲基化作用。經AMP與致癌物聯(lián)合作用的MCF-10A細胞中,自P10開始,U條帶亮度明顯增強,M條帶亮度則相應減弱,表明AMP可顯著誘導ATM基因啟動子區(qū)域發(fā)生去甲基化。
　　上述研究結果表明A