轉移抑制因子nm23-H1與肺癌MAPK通路支架激酶KSR的相互作用關系研究.pdf

1、背景與目的 肺癌既是全世界發(fā)病率和死亡率增長最快，對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤，也是臨床治療療效最差的惡性腫瘤。肺癌的侵襲轉移是導致肺癌病人治療失敗和死亡的首要原因。已有的研究表明，肺癌侵襲轉移是一個受多基因調控的極其復雜的過程，在這個過程中，一些基因起正向調控作用，而另一些則起負向調控作用。許多研究已經(jīng)證明，轉移抑制因子nm23-H1在肺癌中的低表達水平與肺癌的高轉移性和較差的臨床預后有關(如生存率、淋巴結轉移等)，而MAPK

2、通路可能是nm23-H1調控的“肺癌轉移抑制級聯(lián)”的下游信號傳導通路。Ras激酶抑制劑(KSR)是在1995年發(fā)現(xiàn)的一個新的基因，其功能主要是作為一個支架蛋白組裝MAPK及其上游調控子形成多蛋白復合體，從而加速MAPK通路的信號傳導。已有的研究結果表明，nm23-H1具有組氨酸激酶活性，而KSR的磷酸化狀態(tài)與KSR在MAPK信號通路中的作用有關。迄今，有關nm23-H1作為組氨酸激酶是否可通過改變KSR的磷酸化狀態(tài)來影響MAPK通路的信

3、號傳導，從而抑制肺癌轉移的研究，國內外均無報道。因此本研究的目的就是探討nm23-H1與KSR之間是否存在相互作用關系，nm23-H1基因調控KSR的分子靶點，以及nm23-H1基因點突變對KSR基因的功能有何影響，為最終闡明nm23-H1調控肺癌轉移的分子機制提供理論基礎和實驗依據(jù)。 方法 本研究應用基因重組技術構建野生型和突變型pET28a-nm23-H1原核表達載體，pCMV-Tag2b-KSR，pCMV-Tag2b-N

4、-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表達載體，并分別表達原核和真核蛋白，通過反相高效液相色譜技術(rHPLC)和放射自顯影的方法研究原核表達蛋白的生物學活性；同時以轉染了野生型和突變型pEGFP-nm23-H1的L9981細胞株和轉染了pCMV-Tag2b-KSR，pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR的293T細胞株為研究對象，應用免疫共沉淀方法檢測nm23-H1與KSR是否具有相互作用關系；應用

5、體外激酶活性實驗方法檢測原核表達的野生型和突變型nm23-H1蛋白與真核表達的KSR，N-KSR和C-KSR之間是否存在磷酸化的關系， 結果 本研究在國內外首次觀察到：(1)本研究成功構建了pET28a-nm23-H1<'wT>、pET28a-nm23-H1<'P96S>、pET28a-nm23-H1<'Hl8F>、DET28a-nm23-H1<'S120G>，pET28a-nm23-H1<'s44A>和pET28a-nm23

6、-H1<'P96s-S120G>原核表達載體。質粒轉入BL21(DE3)菌株后，蛋白表達量高，目的蛋白占細菌總蛋白量平均為45.98％，蛋白表達除pET28a-nm23-H1<'P96S-S120G>以包涵體形式表達外，其余均以可溶性表達為主；表達的目的蛋白能夠通過Westernblot鑒定。(2)野生型和突變型nm23-H1蛋白具有不同的NDPK活性，活性由大到小依次為nm23-H1<'WT>、nm23-H1<'S120G>、nm23

7、-H1<'P96S>、nm23-H1<'S44A>，nm23-H1<'Hll8F>和nm23-H1<'P965-S120G>。其中nm23-H1<'P96S>與mm23-H1<'s44A>間，以及nm23-H1<'Hll8F>與nm23-H1<'P96S-S120G>間NDPK活性比較無顯著性差異(P>0.05)，而其余任何組間比較均有非常顯著性差異(P<0.01)。(3)野生型和突變型nm23-H1蛋白具有不同的自身磷酸化活性，自身絲

8、氨酸和組氨酸磷酸化活性由大到小依次為nm23-H1<'P96S>、nm23-H1<'WT>、nm23-H1<'S44A>，nm23-H1和nm23-H1<'Hll8F>。其中nm23-H1<'WT>與nm23-H1<'S44A>間絲氨酸磷酸化活性比較無顯著性差異(P>0.05)，而其余各組間比較均有非常顯著性差異(P<0.01)。線性相關性分析結果顯示：野生型和突變型nm23-H1原核表達蛋白自身絲氨酸與組氨酸磷酸化活性間

9、呈非常顯著性正相關(r=0.985，P<0.01)。(4)本研究從pCMV-Tag2b-KSR載體上成功構建出pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表達載體；并成功地將上述三種真核表達載體轉染293T細胞，獲得Flag-KSR，F(xiàn)lag-N-KSR和Flag-C-KSR融合蛋白，目的蛋白可以通過Western blot鑒定。(5)免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)無論在轉染了pEGFP-nm23-H1的L9981細胞、還

10、是轉染了DCMV-Tag2b-KSR的293T細胞，nm23-H1的免疫沉淀物中均能檢測到人或鼠KSR的存在。其中在L9981細胞，各組KSR的表達量接近一致，經(jīng)F檢驗不具有顯著性差異(P>0.05)；在293T細胞，各組KSR的表達量從大到小依次為Flag-N-KSR，F(xiàn)lag-KSR和Flag-C-KSR，各組間KSR表達水平比較具有非常顯著性差異(P<0.01)；兩兩比較：任何兩組間比較均有非常顯著性差異(P<0.01)。該研究結

11、果表明nm23-H1與KSR之間存在相互作用關系，這種相互作用關系主要發(fā)生于KSR的氨基端，與nm23-H1有無突變無明顯關系。(6)體外激酶活性實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lag-KSR和Flag-N-KSR能被nm23-H1磷酸化，而Flag-C-KSR不能被磷酸化，磷酸化水平由高到低依次為Flag-N-KSR，F(xiàn)lag-KSR和Flag-C-KSR，經(jīng)F檢驗具有非常顯著性差異(P<0.01)：兩兩比較：任何兩組間比較均有非常顯著性差異(P<0.0

12、1)，該結果說明nm23-H1與KSR之間具有磷酸化關系，nm23-H1調控KSR的分子靶點位于KSR的氨基端：野生型和突變型nm23-H1蛋白磷酸化KSR的實驗結果顯示，由于不同蛋白具有不同的組氨酸激酶活性，因此KSR被磷酸化的強弱不等。其活性強度由大到小依次為nm23-H1<'WT>、nm23-H1<'S120G>、nm23一H1<'P96S>，nm23-H1<'S44A>和nm23-HI<'H118F>，經(jīng)F檢驗具有非常顯著性差異

13、(P<0.01)。兩兩比較：nm23-H1<'WT>與nm23-H1<'S120G>間，nm23一H1<'P96S>，nm23-H1<'S44A>間組氨酸激酶活性比較均無顯著性差異(P>0.05)，而其余任何兩組間比較均有非常顯著性差異(P<0.01)。該結果說明不同位點的nm23-H1基因點突變對nm23-H1蛋白磷酸化KSR的能力具有不同的影響。 結論 (1)成功構建了pET28a-nm23-H1<,'WT>、pET28a

14、-nm123-Hl<'P96s>、pET28a-nm23-H1<'H118F>，pET28a-nm23-H1<'S120G>和pET28a-nm23-H1<'s44A>原核表達載體，并表達出具有活性的野生型和突變型nm23-H1蛋白：成功構建了pCMV-Tag2b-KSR，pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表達載體，并獲得Flag-KSR，F(xiàn)lag-N-KSR和Flag-C-KSR融合蛋白；(2)不同

15、位點的nm23-H1基因點突變對rim23-H1蛋白NDPK和自身磷酸化活性具有不同的影響；(3)nm23-H1與KSR具有相互作用關系，這種相互作用關系主要發(fā)生于KSR的氨基端，與nm23-H1有無突變無明顯關系；(4)nm23-H1與KSR之間的關系主要為磷酸化關系，nm23-H1調控KSR的分子靶點位于KSR的氨基端，不同位點的nm23-H1基因點突變對nm23-H1蛋白磷酸化KSR的能力具有不同的影響，nm23-H1抑制肺癌轉移