以重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP為載體的結(jié)合疫苗的制備及免疫原性研究.pdf

1、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，Nm)是專一人致病的革蘭陰性雙球菌，依據(jù)莢膜多糖的化學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)，可分為13個血清型(A、B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E、W135)。95％以上的病例為A、B、C、Y和W135五個血清型所致。盡管A、C、Y、W135群的莢膜多糖（TI-2抗原）免疫原性弱，但將其與蛋白載體結(jié)合后（轉(zhuǎn)變其為TD抗原），可以誘導(dǎo)出滿意的保護(hù)性。B群莢膜多糖是[N-乙酰神經(jīng)氨酸-α-

2、(2-8)]，其免疫原性弱，且為自身抗原，即使與蛋白載體結(jié)合也不能取得良好效果。至今，外膜蛋白(outer membrane protein)疫苗是預(yù)防B群菌株暴發(fā)流行的唯一選擇，但是這類疫苗有株特異性(strain specific)，只對流行菌株有保護(hù)性。Nm全基因組測序后，運用反向疫苗學(xué)(reverse vaccinology)的方法，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個在所有B群Nm中均較保守的蛋白，免疫原性強，且保護(hù)性明顯。其中最引人注目的是fHBP(

3、factor H binding protein)。以該蛋白為主要成分的疫苗正進(jìn)行臨床試驗。
　　本研究以重組B群腦膜炎奈瑟菌外膜蛋白fHBP為載體與C群多糖(group C meningococcal polysaccharide，GCMP)共價結(jié)合，制備結(jié)合疫苗，免疫小鼠，檢測小鼠血清中針對B群和C群腦膜炎奈瑟菌的殺菌抗體，評價該重組蛋白作為結(jié)合疫苗載體的可行性及針對B群Nm的交叉保護(hù)性。研究方法是擴增fhbp并連接到pET3

4、0a(+)表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，鎳親和層析柱純化rfHBP，CNBr活化法將rfHBP與GCMP共價結(jié)合，制備結(jié)合疫苗，免疫小鼠，間接ELISA法檢測血清中GCMP抗體和rfHBP抗體滴度，TTC法檢測結(jié)合物誘導(dǎo)的分別針對B群和C群Nm的殺菌抗體水平。本研究成功擴增fhbp并連接至pET30a(+)表達(dá)載體上，大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)rfHBP，純化后與GCMP結(jié)合。結(jié)合物免疫小鼠后，檢測到的針

5、對GCMP的IgG抗體滴度與GCMP組比較有明顯加強效應(yīng);三針免疫后，針對C群Nm的殺菌抗體滴度高于GCMP對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);針對B群Nm的殺菌抗體滴度與rfHBP對照組間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;兩組結(jié)合物誘導(dǎo)的分別針對B群Nm CMCC29361株和ATCC700111株的殺菌抗體滴度間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果顯示結(jié)合疫苗免疫小鼠后檢測到的針對C群Nm的殺菌抗體高于單獨GCMP組，證明該重組蛋白可作