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文檔簡介
1、目的:觀察比較SD大鼠在骨折合并腦外傷以及在單純骨折時,骨折愈合的過程中骨痂內(nèi)血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的表達變化;探討VEGF在大鼠骨折合并腦外傷后的骨折加速愈合中的作用機制,以期為臨床選擇性地應(yīng)用VEGF基因療法治療難治性骨折提供理論依據(jù)。 方法:SD大鼠66只分為3組:正常對照組(N)6只,骨折組(F)30只,骨折合并腦外傷組(TBI+F)30只。 腦外傷模型采用改進的Marmarou自由落體裝置撞擊大鼠顱骨制作
2、彌漫性中度腦損傷模型。骨折模型制造方法:于左側(cè)下肢膝關(guān)節(jié)處縱向剪開皮膚,暴露并剝離膝關(guān)節(jié)韌帶,在脛骨髁間處鉆孔,沿髓腔方向插入直徑約25mm的無菌克氏鋼針。在脛骨中上1/3處鈍性剝離肌肉筋膜,橫向折斷脛骨,逐層關(guān)閉切口。 SD大鼠編號稱重后,10%ZK合氯醛腹腔注射(3ml/kg),麻醉生效后固定于特制手術(shù)臺上,手術(shù)過程均在嚴格無菌條件下進行,術(shù)后放置于籠中自由活動、隨意進食水。 F組和TBI+F組動物,分別于術(shù)后第3d
3、、7d、14d、24d、42 d各處死6只進行X線攝片,以觀察骨折修復(fù)過程和效果。并在距離骨折斷端大約1cm處截取骨痂標本,取其中一半迅速去除軟組織,用冷生理鹽水沖凈血液后置液氮中保存,用于RT-PCR檢測。一半組織用于光鏡觀察和免疫組化染色。 結(jié)果: 1 X線觀察 1.1 F組:骨折后3、7、14d骨折線清晰,未見骨痂形成;24d骨折線較清晰,有骨痂形成,量較少;42d骨折線模糊,仍隱約可見,骨折周圍有大量
4、骨痂形成。 1.2 TBI+F組:骨折后3、7d骨折線清晰,未見骨痂形成;14d骨折線較清晰,可見少量骨痂形成;24d骨折線變得模糊,骨折周圍有較多骨痂形成;42d骨折線消失,傷肢已基本愈合,骨折周圍可見大量骨性骨痂形成,局部增粗,骨密度較高。 2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測 2.1 F組骨折后3d,未見到有明顯VEGF的表達;在骨折后7d開始出現(xiàn)VEGF的表達且此后表達持續(xù)至24d時,至42d已
5、經(jīng)見不到VEGF的表達。 2.2 TBI+F組骨折后3d即開始出現(xiàn)VEGF的表達,此后表達逐漸增強,持續(xù)到24d。至42d已經(jīng)見不到VEGF的表達。 3 光鏡觀察 3.1 F組骨折后3d,骨折端可見到少量肉芽組織形成;7d時可見到肉芽組織長入骨折端,并有軟骨細胞形成;14d可見新生骨小梁形成;24d后,骨小梁開始相互連接;骨折后42d骨小梁逐漸開始塑形,向板層骨轉(zhuǎn)化。 3.2 TBI+F組骨折后3d
6、,骨折端可見肉芽組織形成:骨折后7d,肉芽組織長入骨折端,并有軟骨形成,個別可見到新生骨小梁形成;骨折后14d可見新生骨小梁形成;骨折后24d骨小梁開始相互連接、塑形;骨折后42d骨小梁開始向板層骨轉(zhuǎn)化。 4 免疫組織化學(xué)染色 4.1 F組骨折后3d,骨折端少量肉芽組織內(nèi)偶爾可見到VEGF陽性染色細胞;骨折后7d骨折端骨細胞、成軟骨細胞和肉芽組織內(nèi)纖維母細胞、血管內(nèi)皮細胞VEGF呈陽性染色,新形成的軟骨基質(zhì)VEGF呈陽
7、性染色;骨折后14dVEGF在成骨細胞、軟骨細胞和成纖維細胞均呈強陽性染色;骨折后24d,在軟骨細胞、成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞中VEGF呈陽性表達;骨折后42d,VEGF僅在部分軟骨細胞上發(fā)現(xiàn)有陽性染色。 4.2 TBI+F組骨折后3d骨折端肉芽組織內(nèi)可見部分細胞呈VEGF陽性;骨折后7d骨折端骨細胞、成軟骨細胞和纖維母細胞和新形成的軟骨基質(zhì)VEGF呈陽性染色,肉芽組織中纖維母細胞、血管內(nèi)皮細胞VEGF亦呈陽性染色;骨折后14d
8、VEGF在成骨細胞、成軟骨細胞、肥大的軟骨細胞和成纖維細胞均呈強陽性染色;骨折后24d在成熟軟骨細胞、肥大軟骨細胞、成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞中VEGF呈陽性表達;骨折后42dVEGF僅在部分軟骨細胞上發(fā)現(xiàn)有陽性染色。 5 圖像分析表明:F組VEGF表達從7d開始出現(xiàn),持續(xù)到3周左右達高峰:TBI+F組VEGF表達3d開始出現(xiàn),2周達高峰,并持續(xù)到3周左右。在3、7d時,TBI+F組VEGF表達較F組顯著增高,P<0.01,有統(tǒng)計
9、學(xué)意義;在14d時,TBI+F組VEGF表達較F組增高,P<0.01,有統(tǒng)計學(xué)意義;至24d時,TBI+F組和F組VEG-F表達無明顯區(qū)別,P>0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義;至42d時,兩組均無表達。 結(jié)論: 1 骨折愈合過程需要多因子參與、協(xié)調(diào),VEGF有可能是作為骨折愈合過程中的一種重要因子在發(fā)揮作用。 2 單純骨折后3周左右為VEGF表達的高峰期;中樞神經(jīng)損傷合并骨折后2-3周為VEGF表達的高峰期,其表達高峰
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