豬鏈球菌2型：5型弱毒株交叉保護(hù)性與類Ⅳ型分泌系統(tǒng)在致病中的作用機(jī)制.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis）是重要的人獸共患病原菌，在世界范圍內(nèi)均有分布。該菌可通過呼吸道及黏膜途徑感染人畜引起敗血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎及腦膜炎等臨床病癥。豬鏈球菌病是養(yǎng)豬業(yè)中嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一，由病死豬傳染給人可導(dǎo)致公共衛(wèi)生事件。中國于1998年與2005年先后兩次暴發(fā)人感染豬鏈球菌2型（S.suis2）的群體事件，累計(jì)引起52人死亡，其中鏈球菌中毒性休克綜合征(Streptococcal tox

2、ic shock syndrome，STSS)患者死亡最多(占96.2％)。這些患者病程通常只有1-2d，臨床主要表現(xiàn)為急性高熱、低血壓、彌散性血管內(nèi)凝集與多臟器功能衰竭，不同于以往的緩和性的豬鏈球菌感染。研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)暴發(fā)的這兩次豬鏈球菌2型分離株為強(qiáng)毒ST7型菌株，含有獨(dú)特的89K致病島。疫苗是預(yù)防多種豬病的重要措施之一，但豬鏈球菌疫苗開發(fā)研究緩慢，現(xiàn)有的豬鏈球菌疫苗存在接種劑量大、免疫效果不穩(wěn)定與對其它非2型感染性豬鏈球菌強(qiáng)毒株交叉

3、保護(hù)性差等缺陷。
　　本課題旨在:(1)篩選獲得可對流行率較高的S.suis2與S.suis9兩種血清型強(qiáng)毒株提供較好交叉免疫保護(hù)的弱毒活疫苗候選菌株;(2)闡明豬鏈球菌2型類Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)virD4基因在SS2致病中的作用;(3)VirD4介導(dǎo)的肽酰脯氨酰折疊酶PrsA誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制。
　　1.豬鏈球菌5型XS045活疫苗候選株對2型與9型強(qiáng)毒株感染提供交叉保護(hù)
　　通過黏附感染與血清學(xué)分析獲得1株高黏

4、附力5型XS045候選株（黏附率達(dá)26.7％），致病性與毒力基因篩查結(jié)果顯示該菌株對上皮細(xì)胞毒性小，對小鼠、斑馬魚與仔豬致病性均較低，菌株先天缺失Suilysin、MRP與DltA等毒力因子，含有已報(bào)道的S.suis大部分免疫原性蛋白。XS045活菌在小鼠體內(nèi)定植能力較強(qiáng)，可在血液與臟器中持續(xù)存在兩周以上，安全性較好。小鼠模型免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示XS045活菌免疫原性較好，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體（加強(qiáng)免疫后血清效價(jià)達(dá)1∶25600）

5、，免疫小鼠可抵抗致死劑量的S.suis2型（HA9801）與S.suis9型(JX13)強(qiáng)毒菌株的感染，保護(hù)率分別為100％與85％。黏附拮抗、全血?dú)⑼淌烧{(diào)理與抗體結(jié)合能力檢測發(fā)現(xiàn)XS045活菌免疫對HA9801與JX13菌株感染提供交叉保護(hù)的可能機(jī)制是該菌包含有這兩株強(qiáng)毒細(xì)菌共有表面抗原，XS045高免血清與S.suis2型與S.suis9型菌株表面蛋白反應(yīng)性較強(qiáng)，可有效結(jié)合S.suis2與S.suis9全菌;高免血清預(yù)處理的S.

6、suis2型與S.suis9型菌體對上皮細(xì)胞HEp-2黏附力下降，更易于被吞噬細(xì)胞或全血吞噬與清除。這說明XS045免疫后有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生交叉調(diào)理作用的抗體是抵抗S.suis2型與S.suis9型強(qiáng)毒株感染的可能原因之一。
　　2.豬鏈球菌2型類Ⅳ型分泌系統(tǒng)關(guān)鍵因子VirD4氧化應(yīng)激后可誘導(dǎo)PrsA等蛋白差異分泌
　　同源重組法構(gòu)建豬鏈球菌2型HA9801的T4SS同源蛋白VirD4與VirB4基因缺失株，VirD4參與細(xì)菌

7、毒力，具有抗吞噬作用，VirD4突變株更容易被不同來源的吞噬細(xì)胞所吞噬，其中以骨髓源巨噬細(xì)胞(BMDM)最明顯，吞噬量是親本株的3倍。體內(nèi)體外感染試驗(yàn)證實(shí)VirD4參與S.suis2型菌株的早期致炎反應(yīng)，缺失突變株感染致宿主炎癥因子分泌顯著下調(diào)。過氧化氫體外刺激與RAW264.7細(xì)胞模型證實(shí)氧化應(yīng)激可分別使VirD4轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)55.3與9.8倍;對過氧化氫應(yīng)激后親本菌株與VirD4突變株的培養(yǎng)上清分別進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳與差異蛋白質(zhì)譜鑒

8、定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)親本株與VirD4突變株分別有33個(gè)與148個(gè)差異在1.5倍以上的分泌蛋白;其中親本株豐度較高且上調(diào)差異在3倍以上的分泌蛋白有3個(gè)，包括肽酰脯氨酰折疊酶PrsA(Parvulin-like peptidyl-prolyl isomerase);VirD4突變株中明顯上調(diào)的則有7個(gè)。這些蛋白大多為多功能蛋白，可能在DNA損傷修復(fù)、核酸代謝、糖代謝、應(yīng)激調(diào)控與細(xì)菌致病性中扮演重要作用，差異蛋白在轉(zhuǎn)錄水平得到驗(yàn)證，這為進(jìn)一步分析T

9、4SS效應(yīng)因子的功能提供了基礎(chǔ)。
　　3.PrsA可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并刺激細(xì)胞釋放炎癥因子
　　體外原核表達(dá)與純化豬鏈球菌2型T4SS相關(guān)差異分泌蛋白PrsA，體外刺激小鼠bEND3.0與RAW264.7細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)PrsA因子具有劑量（10-100μg/ml）與時(shí)間依賴的細(xì)胞毒性與致炎效應(yīng)，且致細(xì)胞死亡作用與細(xì)菌溶血素樣因子的穿孔機(jī)制無關(guān);經(jīng)自噬、凋亡、焦亡與壞死等細(xì)胞死亡方式鑒定發(fā)現(xiàn)PrsA主要引起細(xì)胞焦亡，并伴隨壞死性凋亡，

10、細(xì)胞焦亡相關(guān)抑制劑Ac-YVAD-cmk(100μM)可以明顯緩解該蛋白引起的細(xì)胞死亡。體外截短表達(dá)PrsA不同區(qū)域蛋白:PrsA折疊酶功能域PPIase、包含PPIase的N端結(jié)構(gòu)域截短蛋白片段(NP)以及包含PPIase的C端結(jié)構(gòu)域截短蛋白片段(PC)，分別刺激小鼠bEND3.0與RAW264.7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)N端與C端結(jié)構(gòu)域?yàn)镻rsA誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所必需，折疊酶酶學(xué)催化結(jié)構(gòu)域PPIase并不主導(dǎo)PrsA的細(xì)胞毒性與致炎效應(yīng);通過RNA干擾

11、tlr2和myd88，發(fā)現(xiàn)TLR2不是PrsA的模式識別受體，TLR2-MyD88途徑不參與PrsA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。上述研究為豬鏈球菌PrsA在豬鏈球菌致病中的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述:本研究首次報(bào)道獲得了可對強(qiáng)毒豬鏈球菌2型與9型菌株提供交叉保護(hù)力的XS045活疫苗候選株;證明豬鏈球菌2型類Ⅳ型分泌系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白VirD4介導(dǎo)細(xì)菌的致病性，氧化應(yīng)激可顯著上調(diào)其表達(dá)，可能參與PrsA等因子的分泌;PrsA可以誘導(dǎo)炎癥因子釋放，