雌激素樣及（抗）孕激素樣化學(xué)物對子宮內(nèi)膜相關(guān)生物標(biāo)志物影響的體外研究.pdf

1、本文主要從以下三個方面展開論述：
　　第一部分 Ishikawa細(xì)胞中子宮內(nèi)膜相關(guān)生物標(biāo)志物表達(dá)
　　研究目的：
　　建立子宮內(nèi)膜Ishikawa細(xì)胞模型，分別通過檢測孕激素受體(PR)、雌激素受體(ER)、白血病抑制因子(LIF)、肝素結(jié)合生長因子(Hb-EGF)、環(huán)氧化酶2(COX-2)、胰島素生長因子結(jié)合蛋白1(IGFBP-1)、血管內(nèi)皮生長因子受體1(VEGF-R1)、白介素1β(IL-1β)八個子宮內(nèi)膜容受性

2、相關(guān)目的基因以及G6PDH、ALAS1、PGK-1、b-2M、b-actin、HPRT、PBGD、RPII八個能在不同細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因在該細(xì)胞模型中的表達(dá)，以驗證該細(xì)胞模型具備子宮內(nèi)膜特異性與穩(wěn)定性。通過檢測在17β-雌二醇干預(yù)下孕激素受體(PR)、胎盤堿性磷酸酶樣蛋白2(ALPPL2)、GO/GS期開關(guān)基因(GOS2)的表達(dá)，以確定17β-雌二醇干預(yù)下Ishikawa細(xì)胞模型基因表達(dá)的穩(wěn)定性。
　　研究方法：
　　

3、1.八個目的基因以及八個參考基因mRNA在Ishikawa細(xì)胞模型中的表達(dá)
　　Ishikawa細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)72小時后，采用RT-qPCR檢測細(xì)胞中預(yù)先選定的八個目的基因：PR、ER、Hb-EGF、LIF、COX-2、IGFBP-1、VEGF-R1、IL-1β及參考基因G6PDH、ALAS1、PGK-1、b-2M、b-actin、HPRT、PBGD、RPII[1](各8個)mRNA的表達(dá)并采用Cq值表示其相對表達(dá)量。
　　2

4、.17β-estradiol干預(yù)下PR、ALPPL2、GOS2mRNA在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)
　　在接種密度50000cells/ml情況下，Ishikawa細(xì)胞無激素常規(guī)培養(yǎng)72小時，致細(xì)胞亞融合狀態(tài)后添加不同濃度17β-estradiol干預(yù)48小時。采用RT-qPCR檢測細(xì)胞中PR、ALPPL2、GOS2mRNA的表達(dá)，及PRmRNA相對于三種不同參考基因(ALAS1， G6PDH和?2M)的表達(dá)。EC50表示化學(xué)物

5、產(chǎn)生50％最大效應(yīng)的濃度。“S函數(shù)”量效曲線根據(jù)實時定量PCR結(jié)果制定，橫坐標(biāo)為17β-estradiol濃度，縱坐標(biāo)為目的基因擴(kuò)增Cq值的歸一化比值(Normalized Ratio)。
　　實驗結(jié)果：
　　1.八個目的基因和八個參考基因均在Ishikawa細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。
　　2.17β-estradiol干預(yù)下PR、ALPPL2、GOS2mRNA呈現(xiàn)濃度依賴性上調(diào)性表達(dá)， ALPPL2和GOS2的mRNA表達(dá)水平

6、高于PR，但PRmRNA上調(diào)性表達(dá)的增長倍數(shù)高于ALPPL2和GOS2。PRmRNA相對于三組不同管家基因：PRmRNA表達(dá)均上升，組間無差異(P＞0.05)。
　　實驗結(jié)論：
　　本實驗證明PR、ER、LIF等八個目的基因以及G6PDH、ALAS1、b-2M等八個內(nèi)參基因在該Ishikawa細(xì)胞模型中的穩(wěn)定表達(dá)，從mRNA水平上驗證了Ishikawa細(xì)胞模型在一定程度上具備子宮內(nèi)膜容受性生物特征和基因表達(dá)的穩(wěn)定性。本實驗同

7、時證實了17β-雌二醇干預(yù)下下Ishikawa細(xì)胞PRmRNA上調(diào)性表達(dá)的穩(wěn)定性。
　　第二部分 雌激素及雌激素樣化學(xué)物對Ishikawa細(xì)胞PR表達(dá)的影響
　　研究目的：
　　本實驗利用Ishikawa細(xì)胞模型，以雌激素物質(zhì)17β雌二醇(17β-estradiol)、乙烯雌酚(DES)以及抗孕激素米非司酮(RU486)干預(yù)作為參考，檢測“Feasibility study”項目中十一種有毒化學(xué)物：乙酰乙酸甲酯(MAA

8、)、草氨酸(GLU)、甲氧基乙酸(methoxyacetic acid)、氯化鈉(sodium chloride)、氯化鉻(Cadmium choride)、多菌靈(Carbendazim)、硝基苯(Nitrobenzene)、除草醚(Nitrofen)、烯菌酮(Vinclozolin)、雙酚A(BPA)、4-壬基酚(4-NP)對PR表達(dá)的影響，以確認(rèn)是否具有雌激素樣作用并區(qū)分其作用的強(qiáng)弱。
　　研究方法：
　　1.雌激素、

9、雌激素樣化學(xué)物對Ishikawa細(xì)胞中PR蛋白及mRNA表達(dá)的影響
　　Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)致細(xì)胞亞融合狀態(tài)后按照梯度濃度添加17β-estradiol、RU486、DES以及11種待測化學(xué)物各干預(yù)48小時。采用RT-qPCR檢測各干預(yù)組PRmRNA的表達(dá)。EC50值描述及“S函數(shù)”量效曲線建立同前。采用 WesternBlotting檢測各干預(yù)組PR蛋白的分泌。
　　2.AlamarBlue分析
　　培養(yǎng)板中處于

10、亞融合狀態(tài)下Ishikawa細(xì)胞，分為實驗組(17β-estradiol、4-NP、DES和BPA不同梯度濃度分別干預(yù)48小時)，另設(shè)對照組(培養(yǎng)液添加0.1％ETOH)，各組均設(shè)復(fù)孔。采用AlamarBlue法檢測各組不同濃度下的細(xì)胞活性。
　　實驗結(jié)果：
　　1.17β-estradiol、DES及“Feasibility Study”中BPA、4-NP干預(yù)下PRmRNA呈現(xiàn)上調(diào)性表達(dá)，并且通過qPCR結(jié)果“S函數(shù)”量效

11、曲線能夠建立。RU486與其它的“Feasibility Study”化學(xué)物質(zhì)干預(yù)下沒有出現(xiàn)PRmRNA的上調(diào)性表達(dá)。17β-estradiol(EC50=2.44×10-11 M)、DES(EC50=2.61×10-11 M)的作用強(qiáng)于BPA(EC50=2.98×10-7 M)WesternBlotting結(jié)果顯示17β-estradiol，4-NP，DES，BPA干預(yù)下PR蛋白表達(dá)增加，與陰性對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.0

12、5)。
　　2.AlamarBlue結(jié)果顯示PRmRNA上調(diào)性表達(dá)時沒有產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　實驗結(jié)論：
　　1.本實驗 Ishikawa細(xì)胞模型被證實不僅能夠檢測出化合物是否具備雌激素樣作用，還能區(qū)分不同化學(xué)物激素樣作用的強(qiáng)、弱。
　　2.“Feasibility Study”中的雙酚A、4-壬基酚具備雌激素樣作用，乙酰乙酸甲酯(MAA)本實驗檢測為雌激素陰性作

13、用化學(xué)物。
　　第三部分 (抗)孕激素及(抗)孕激素樣化學(xué)物對Ishikawa細(xì)胞PR及SULT1E1表達(dá)的影響
　　研究目的：
　　本實驗通過文獻(xiàn)檢索搜集出一些能和PR相互作用的化學(xué)物質(zhì)和自然物質(zhì)，并通過基因芯片技術(shù)確定抗孕激素RU486干預(yù)下Ishikawa細(xì)胞最敏感變化基因。采用Ishikawa細(xì)胞模型檢測上述化學(xué)物質(zhì)干預(yù)下對PR及最敏感基因表達(dá)的影響，確認(rèn)其是否具有(抗)孕激素樣作用并區(qū)分作用的強(qiáng)弱。
　

14、　研究方法：
　　1.檢測Ishikawa細(xì)胞模型中在P4、P4+RU486影響下的敏感變化基因
　　Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)致細(xì)胞亞融合狀態(tài)后，用17β-estradiol(10-8 M)繼續(xù)誘導(dǎo)72小時，隨后分別采用 P4(10-8M)單獨干預(yù)、P4+RU486(each，10-8 M)混合干預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞各48小時。使用Affymetrix基因芯片對RU486、P4+RU486不同干預(yù)下Ishikawa細(xì)胞基因表達(dá)進(jìn)行高通

15、量檢測，鑒定出其變化敏感的基因，接受最大錯誤發(fā)現(xiàn)率為10％即q=0.01，并以平均最小1.5倍變化作為基因差異表達(dá)的評價標(biāo)準(zhǔn)
　　2.觀察P4、P4+RU486對Ishikawa細(xì)胞中的PR、敏感基因蛋白及mRNA表達(dá)的影響
　　Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)致細(xì)胞亞融合狀態(tài)后，用17β-estradiol(10-8 M)繼續(xù)誘導(dǎo)72小時，隨后分別采用梯度濃度P4單獨干預(yù)、梯度濃度RU486添加至P4(固定濃度，10-8 M)混合

16、干預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞各48小時。0.1％濃度DMSO作為低水溶性化學(xué)物的溶劑，一并干預(yù)作為陰性對照。采用RT-qPCR檢測各干預(yù)組PR及最敏感基因mRNA的表達(dá)。EC50值描述及“S函數(shù)”量效曲線建立同前。蛋白表達(dá)水平采用 Westernblotting檢測。
　　3.其它待測物質(zhì)對Ishikawa細(xì)胞中的敏感基因mRNA表達(dá)的影響
　　Ishikawa細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)后之后用17β-estradiol(10-8 M)繼續(xù)誘導(dǎo)7

17、2小時， ZK137316、醋酸烏利司他(UPA)、4-NP、BPA及自然物質(zhì)芹菜素(Apigenin)以不同濃度(10-4-10-12M)與Progesterone(固定濃度，10-8 M)分別混合干預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞各48小時。采用RT-qPCR檢測各干預(yù)組最敏感基因mRNA的表達(dá)。EC50值描述及“S函數(shù)”量效曲線建立同前。
　　實驗結(jié)果：
　　1.Affymetrix芯片上28869個基因中共發(fā)現(xiàn)有69個基因在接受P4+RU

18、486干預(yù)后與P4干預(yù)相比差異表達(dá)。雌激素硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT1E1)變化倍數(shù)位居第一位。
　　2.P4單獨干預(yù)下，PRmRNA呈現(xiàn)濃度依賴性下調(diào)表達(dá)，SULT1E1mRNA呈現(xiàn)濃度依賴性上調(diào)表達(dá)。孕酮對PRmRNA的下調(diào)及SULT1E1mRNA的上調(diào)在RU486干預(yù)下受到濃度依賴性的拮抗。ZK137316、UPA，4-NP， bisphenol A以及Apigenin培養(yǎng)組中受拮抗并呈現(xiàn)濃度依賴性。0.1％DMSO干預(yù)下，對P

19、RmRNA、SULT1E1mRNA的表達(dá)沒有變化。WesternBlotting結(jié)果顯示，和0.1％DMSO對照組相比，P4單獨干預(yù)下， PR蛋白表達(dá)減少、SULT1E1蛋白表達(dá)增加。而P4+RU486混合干預(yù)下PR蛋白表達(dá)增加、SULT1E1蛋白表達(dá)增加減少，差異具有統(tǒng)計意義(P﹤0.05)。
　　3.在ZK137316、UPA、4-NP、BPA、API干預(yù)下P4對SULT1E1mRNA的上調(diào)性表達(dá)都產(chǎn)生了濃度依賴性的拮抗，并且

20、能夠建立“S函數(shù)”量效曲線。UPA(EC50=9.0x10-10M)、ZK137316(EC50=6.5x10-9M)表現(xiàn)出對SULT1E1表達(dá)較強(qiáng)的拮抗作用。4-NP(EC50=3.4x10-6M)、BPA(EC50=7.5x10-6M)、API(EC50=9.8x10-7M)則表現(xiàn)出對SULT1E1表達(dá)較弱的拮抗作用。
　　實驗結(jié)論：
　　1.本實驗證明Ishikawa細(xì)胞模型不僅能檢測化合物是否具有(抗)激素樣作用，還