復(fù)極儲備相關(guān)鉀通道在心力衰竭時的變化及相互作用研究.pdf

1、背景與目的:心力衰竭（心衰）時惡性室性心律失常和心源性猝死發(fā)生率增加，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量甚至危及生命。研究顯示心衰時心律失常發(fā)生率增加與復(fù)極儲備障礙或功能喪失關(guān)系密切，復(fù)極儲備主要依賴于快速延遲整流鉀電流(IKr)通道和緩慢延遲整流鉀電流(IKs)通道離子流在心肌復(fù)極過程中相互作用產(chǎn)生的代償性補充，從而緩沖動作電位時程(APD)過度延長。本課題一方面利用兔腹主動脈縮窄心衰模型，研究心衰時心室肌細(xì)胞中KCNH2和KCNQ1基因在mRN

2、A水平表達(dá)的變化情況，以及與動作電位(AP)、IKr通道和IKs通道離子流之間的關(guān)系，探討心衰時復(fù)極儲備改變的特征及機制;另一方面利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將KCNH2和KCNQ1基因?qū)爰?xì)胞，研究二者在mRNA、蛋白及離子通道水平的相互影響，進(jìn)一步探討復(fù)極儲備中離子通道間的相互作用機制。為心衰時惡性室性心律失常及心源性猝死的機制研究提供實驗與理論依據(jù)。
　　研究方法:24只日本大耳白兔隨機分為假手術(shù)組（Sham）和心衰模型組(HF)，每組12

3、只，分別行腹主動脈分離術(shù)和腹主動脈縮窄術(shù)，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)12周，評價一般情況及心臟超聲指標(biāo)，判定HF組模型建立達(dá)標(biāo)情況。Sham組與HF組動物均麻醉取心臟，灌流分離心室肌細(xì)胞，提取總RNA用RT-qPCR方法，比較目的基因KCNH2及KCNQ1的mRNA表達(dá)量在兩組間的差別，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)輔以鉀離子通道阻滯劑多非利特(Dof)和293B藥物，檢測心衰時心室肌細(xì)胞AP，比較復(fù)極至50％的動作電位時程(APD50)、復(fù)極至90％的動作電位時程

4、(APD90)、動作電位幅值(APA)和靜息膜電位（RMP）在各條件下的變化情況，測定心室肌細(xì)胞IKr電流和IKs電流在不同條件下的改變。另一方面應(yīng)用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，將HEK293細(xì)胞隨機分為7組，即單獨將KCNQ1（Q1組）、野生型WT-KCNH2（WT組）、功能獲得型T618I-KCNH2(T618I組)和功能缺失型V535M-KCNH2（V535M組）與空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，及將KCNQ1分別與各功能型KCNH2共轉(zhuǎn)染（依次為Q1+WT組、

5、Q1+T618I組和Q1+V535M組）。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，分別應(yīng)用RT-qPCR和Western Blot方法檢測目的基因在mRNA和蛋白水平的相對表達(dá)量，比較各組間的差別，同時應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測不同功能型KCNH2對KCNQ1電流的影響。
　　研究結(jié)果:
　　(1)與Sham組相比，HF組兔心室肌細(xì)胞KCNH2基因和KCNQ1基因在mRNA水平表達(dá)均顯著降低(P＜0.05)。
　　(2)

6、與Sham組相比，HF組兔心室肌細(xì)胞AP、APD50和APD90均顯著延長(P＜0.05)，其中HF組給予Dof干預(yù)后，AP、APD50和APD90均進(jìn)一步延長(P＜0.05)，若加用293B共同干預(yù)，則AP、APD50和APD90延長程度與單獨給予Dof相比增加更顯著(P＜0.05)。
　　(3)兔心室肌細(xì)胞APA和RMP在Sham組、HF組及給予Dof、293B干預(yù)的HF組中無明顯差異(P＞0.05)。
　　(4) HF

7、組兔心室肌細(xì)胞IKr電流密度與Sham組相比顯著降低(P＜0.05)，給予Dof干預(yù)后，兩組IKr電流密度均顯著下降(P＜0.05)，且HF組表現(xiàn)更為明顯。
　　(5) Sham組和HF組中，兔心室肌細(xì)胞IKr尾電流（IKr,tail）均隨刺激脈沖正移不斷增加，但HF組增加幅值低于Sham組。給予Dof干預(yù)后，兩組的IKr,tail均被抑制，隨刺激脈沖電壓增加抑制效應(yīng)增強，且對HF組作用更明顯。
　　(6) HF組兔心室肌細(xì)

8、胞IKs電流密度與Sham組相比顯著降低(P＜0.05)，給予Dof干預(yù)后IKs電流密度顯著回升(P＜0.05)，但未恢復(fù)至正常水平。
　　(7)不同功能型KCNH2與KCNQ1共轉(zhuǎn)染均可使KCNQ1在mRNA水平的相對表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，Q1+V535M組升高最顯著，Q1+WT組次之，Q1+T618I組升高程度最小。共轉(zhuǎn)染KCNQ1可使不同功能型KCNH2在mRNA水平表達(dá)均出現(xiàn)升高，僅野生型升高程度有統(tǒng)計學(xué)意義(P

9、＜0.05)。
　　(8)不同功能型KCNH2與KCNQ1共轉(zhuǎn)染均可使KCNQ1在蛋白水平表達(dá)升高(P＜0.05)，其中Q1+T618I組作用最顯著，Q1+WT組作用次之，Q1+V535M組作用最弱。共轉(zhuǎn)染KCNQ1可使不同功能型KCNH2在蛋白水平表達(dá)均升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(9)野生型WT-KCNH2與KCNQ1共轉(zhuǎn)染能夠使KCNQ1峰電流密度從152.8±7.5 pA/pF增加至209.3±9

10、.1 pA/pF(P＜0.05)，功能獲得型突變T618I-KCNH2與KCNQ1共轉(zhuǎn)染使KCNQ1峰電流密度升高相對較弱，僅升高至169.2±6.7 pA/pF(P＜0.05)，功能喪失型突變V535M-KCNH2與KCNQ1共轉(zhuǎn)染使KCNQ1峰電流密度升高最為明顯，KCNQ1峰電流密度可升高達(dá)253.5±13.6 pA/pF(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)在mRNA水平，心衰能夠使心室肌細(xì)胞KCNH2和KCNQ

11、1表達(dá)均降低。
　　(2)心衰時心室肌細(xì)胞APD延長，IKr和IKs電流密度降低，復(fù)極貯備功能障礙。抑制IKr電流APD延長增加不大，若同時抑制IKr和IKs兩種電流，則APD延長顯著加重。
　　(3) KCNH2與KCNQ1均能使彼此在mRNA水平的表達(dá)升高，且KCNQ1升高程度與KCNH2的功能呈負(fù)相關(guān)。
　　(4)相似地，KCNH2與KCNQ1均能使彼此在蛋白水平的表達(dá)升高，且KCNQ1升高程度與KCNH2的功能