漸進性力學適應增強骨髓間充質干細胞活性功能及其機制的研究.pdf

1、背景：
　　心臟瓣膜疾病是一類由各種原因引起的瓣膜結構破壞和功能失調并嚴重危害人類健康的疾病,人工心臟瓣膜置換是其主要治療方法,全世界每年逾45萬例患者接受換瓣治療。目前臨床上使用的人工心臟瓣膜主要分為兩類:機械瓣膜和生物瓣膜。雖然它們都能部分替代原有瓣膜的功能從而改善患者生活質量并延長患者生命,但是由于其自身材料和結構等缺陷難以完美替代自身瓣膜并存在多種并發(fā)癥和后遺癥。機械瓣膜置換后需要終生抗凝,因抗凝不當易引起出血、血栓和栓塞

2、;生物瓣膜的血流動力學性能好,但因鈣化和衰壞易導致生物瓣功能障礙,需要10到15年后再次進行瓣膜置換。因此研制有生長和修復能力的組織工程心臟瓣膜(TEHV)已成為心臟瓣膜研制的主要方向。然而,目前研制的TEHV體內移植后均無法適應體內復雜的力學環(huán)境,不能耐受高壓、高速血流的沖擊。
　　生物力學信號是心臟瓣膜生長發(fā)育過程中一種重要的細胞外調控信號,使瓣膜細胞隨著發(fā)育逐步適應高壓高速的血流力學環(huán)境。如何系統(tǒng)模擬瓣膜生理發(fā)育過程中逐漸增

3、高的壓力和血流速度變化等力學信號調控過程,在 TEHV體外構建的過程中從種子細胞培養(yǎng)分化開始就進行仿生性力學漸進性系統(tǒng)訓練、調控,逐步增強種子細胞適應高壓、高速血流沖擊的能力,對研究 TEHV及其它須面對體內復雜應力環(huán)境的組織工程器官具有重大意義。
　　目的：
　　本課題研究漸進性力學適應對 MSCs活性、功能和分化等的影響及相關機制,尋找細胞內力學信號作用的關鍵分子,為基因改造優(yōu)化種子細胞提供理論基礎,探索可顯著改善MSC

4、s耐受高壓、高速血流沖擊的仿生性力學訓練系統(tǒng)方案。
　　方法和結果
　　第一部分漸進性力學適應對MSCs活性功能的影響
　　培養(yǎng)的大鼠MSCs分為6個實驗組分別接受0、5、10和15dyn/cm2剪應力及漸進性增加剪應力0~10和0~15 dyn/cm2處理。Brdu法檢測細胞增殖,劃痕實驗檢測細胞遷移,Elisa檢測細胞分泌,貼壁率檢測細胞粘附及 Tunel檢測細胞凋亡。結果:與靜態(tài)培養(yǎng)的MSCs相比,高恒定剪應力(

5、15dyn/cm2)提高細胞增殖率、遷移率和粘附率(P值均<0.05),同時顯著提高MSCs分泌VEGF、TGF-β1、bFGF和PDGF細胞因子水平(P值均<0.01)。與單純高剪應力(15dyn/cm2)干預的MSCs相比,0~15 dyn/cm2漸進性力學適應提高細胞增殖率、遷移率和粘附率(P值均<0.05),同時提高MSCs分泌VEGF、TGF-β1、bFGF和PDGF細胞因子水平(P值均<0.05)。單純高剪應力(15dyn/

6、cm2)干預的MSCs相比靜態(tài)培養(yǎng)的MSCs細胞凋亡率顯著提高(P<0.01),而0~15 dyn/cm2漸進性力學適應可以顯著減少細胞凋亡(P<0.01)。
　　第二部分漸進性力學適應增強MSCs活性機制研究
　　Western-blot檢測PIM-1等目的蛋白表達,采用siRNA和蛋白抑制劑探索相關分子機制,transwell研究細胞分泌變化對細胞遷移的影響。結果:0~15dyn/cm2漸進性力學適應提高PIM-1蛋白表

7、達以及Akt、p38和ERK蛋白磷酸化水平(P值均<0.05),加入Akt、p38和ERK蛋白抑制劑后,研究發(fā)現(xiàn)p38和ERK蛋白被抑制時PIM-1蛋白表達水平下降(P<0.01),通過siRNA抑制PIM-1基因發(fā)現(xiàn)漸進性力學適應后MSCs增殖率下降(P<0.01)。Transwell結果顯示0~15 dyn/cm2漸進性力學適應顯著提高MSCs遷移率(P<0.05),提示 MSCs細胞分泌水平提高可能促進了細胞遷移。0~15dyn/

8、cm2漸進性力學干預后,MSCs中纖連蛋白(FN)和玻璃粘連蛋白(VN)的表達增加(P<0.05),提示漸進性力學適應可能通過增加這兩種粘附蛋白的表達促進MSCs粘附能力提升。
　　第三部分漸進性力學適應對衰老MSCs活性功能影響
　　取4周齡SD大鼠和24月齡SD大鼠MSCs,研究衰老對MSCs生長狀態(tài)以及耐受剪應力的影響。給予抗氧化劑干預后,記錄細胞群體倍增數(shù),檢測細胞內活性氧自由基(ROS)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OH

9、dG)和蛋白質金屬羰基合物(protein carbonyls)水平,并通過real time PCR檢測p16和p53基因表達。對不同組MSCs分別施加漸進性力學適應,觀察細胞增殖、遷移、分泌、粘附和凋亡的情況。結果:與4周齡SD大鼠來源MSCs相比,24月齡SD大鼠來源MSCs群體倍增數(shù)(PD)明顯下降(P<0.01),細胞內氧化應激水平顯著升高(P<0.05),p16和p53基因表達增加(P<0.05)。在使用抗氧化劑干預后,細胞

10、內氧化應激強度下降(P<0.05),p16和p53基因表達水平下降(P<0.05),群體倍增數(shù)增加(P<0.05)。24月齡SD大鼠來源MSCs在接受漸進性力學適應后,MSCs活性功能未明顯提高,凋亡增加(P<0.05);給予抗氧化劑干預后,漸進性力學適應提高衰老MSCs活性功能及減少凋亡(P<0.05)。
　　第四部分漸進性力學適應誘導細胞分化及其機制研究
　　漸進性力學適應誘導 MSCs向平滑肌樣細胞方向分化,免疫熒光染

11、色法觀察誘導分化后細胞是否表達平滑肌樣細胞特異性標志物平滑肌肌動蛋白(SMA)和鈣調蛋白(Calponin),real time PCR分析SMA和Calponin基因表達,通過特異性蛋白抑制劑探索相關機制。結果:SMA和Calponin免疫熒光染色陽性,提示漸進性力學適應誘導MSCs向平滑肌樣細胞方向分化。Real time PCR結果顯示漸進性力學處理后SMA和Calponin基因表達顯著增加(P<0.01),漸進性力和TGF-β1

12、處理提高這兩種基因表達(P<0.01)。PD98059(ERK阻斷劑)抑制MSCs向平滑肌樣細胞方向分化(P<0.05),提示ERK分子信號通路在調控細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。
　　第五部分漸進性力學適應MSCs種植后在體研究
　　將漸進性力學適應后MSCs和未經(jīng)力學適應MSCs分別種植于脫細胞豬主動脈壁上。采用仿生脈動生物反應器模擬體內力學環(huán)境處理血管后,分光光度法檢測DNA含量,western blot檢測I型膠原含量

13、。將MSCs種植于脫細胞帶瓣管道上并移植于犬腹主動脈,1月后行 B超觀察,并取組織標本行大體觀察、HE染色、DNA和膠原含量測定。結果:在體外模擬實驗中,漸進性力學適應后的MSCs在主動脈壁上存留較多,DNA含量明顯高于對照組(P<0.01),Western blot結果顯示漸進性力學適應后MSCs的I型膠原含量明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P<0.01)。體內實驗發(fā)現(xiàn)兩種移植物均無血栓形成,力學適應后MSCs在移植物上存留較多,DNA含量明顯高

14、于對照組(P<0.01),分泌膠原含量也顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P<0.01)。說明力學適應后 MSCs接種于支架材料后可較好耐受高速、高壓流體力的沖擊。
　　結論：
　　1.本研究系統(tǒng)探索了恒定剪應力和漸進性增加剪應力對培養(yǎng)MSCs的作用,發(fā)現(xiàn)隨著0、5、10和15dyn/cm2剪應力強度逐漸增加, MSCs的增殖、遷移、分泌和粘附能力經(jīng)過力學訓練后得到提高,0~15dyn/cm2漸進性力學適應可以進一步提高細胞增殖、遷移、分

15、泌和粘附能力,同時0~15dyn/cm2漸進性力學適應相比于同等強度下的高恒定剪應力可以減少細胞凋亡。
　　2.研究證實0~15dyn/cm2漸進性力學適應可激活 p38和 ERK信號通路調控的PIM-1蛋白表達從而促進MSCs增殖,提高了MSCs的自分泌能力使其遷移能力增強,并且促進FN和VN蛋白表達使MSCs粘附能力提高,初步闡明了漸進性力學適應提高MSCs活性功能的機制。
　　3.研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠來源 MSCs比青年大

16、鼠來源 MSCs氧化應激水平升高、DNA和蛋白質損傷加重以及活性功能下降。在接受0~15dyn/cm2漸進性力學適應后,老年大鼠來源 MSCs活性功能未見顯著提高,凋亡率也明顯上升。給予抗氧化劑干預后,0~15dyn/cm2漸進性力學適應提高老年大鼠來源MSCs活性功能并減少凋亡。
　　4.0~15dyn/cm2漸進性力學適應可以在體外培養(yǎng)時誘導MSCs向平滑肌樣細胞方向分化,這種誘導能力在結合 TGF-β1后得到進一步增強,ER