維甲酸誘導脊膜膨出胎鼠神經(jīng)損害的觀察和手術(shù)修補實驗.pdf

1、脊髓脊膜膨出等神經(jīng)管缺陷是導致小兒神經(jīng)原性膀胱功能障礙的最主要的病因，可致截癱、大小便失禁、腦積水、性功能障礙、骨骼畸形和精神損害等嚴重后果。胎兒外科手術(shù)可能是早期干預脊髓脊膜膨出的較好方法，但對于手術(shù)效果等還有待利用動物模型等進一步的研究；另外，脊髓脊膜膨出后脊髓損傷，導致膀胱神經(jīng)和肌肉的改變，其相關(guān)神經(jīng)損害及相互關(guān)系目前還未完全明確，需要進一步的研究。以往的脊髓脊膜膨出動物模型多為手術(shù)造?；蚧蛲蛔兿祫游铮c人類的脊髓脊膜膨出的病理

2、生理過程有較大的差異。維甲酸誘導SD孕鼠，產(chǎn)生脊髓脊膜膨出胎鼠，可能是一個較理想的動物模型。
　　 目的：本研究優(yōu)化維甲酸灌喂孕SD大鼠誘導產(chǎn)生脊髓脊膜膨出胎鼠的動物模型，以得到較高的胎鼠脊髓脊膜膨出比率和較低的死胎比率，同時希望脊髓脊膜膨出胎鼠膨出范圍較小。在此基礎上通過對不同胚胎期MMC胎鼠膀胱平滑肌的發(fā)育和神經(jīng)支配情況及脊髓神經(jīng)損害的形態(tài)學觀察，并且對一些脊髓損傷相關(guān)的細胞因子的mRNA進行RT-PCR檢測，以期了解這種損

3、害的時間和空間上的變化及其相互關(guān)系。同時利用這一模型，采用組織工程材料對胎鼠進行脊膜膨出修補實驗，以探索胎內(nèi)手術(shù)方法并了解胎內(nèi)手術(shù)對改善膀胱神經(jīng)支配可能的作用。
　　 材料與方法：
　　 1、維甲酸誘導脊髓脊膜膨出胎鼠動物模型的優(yōu)化：按孕鼠灌喂時間分為3組：孕9天組(孕9天9a.m.左右灌喂維甲酸)，孕9.5天組(孕9天晚11p.m。左右灌喂維甲酸)，孕10天組(孕10天9a.m.左右灌喂維甲酸)。實驗組：SD孕鼠灌喂全

4、反式維甲酸，溶于2ml橄欖油中；對照組：SD孕鼠僅灌喂2ml橄欖油。灌喂劑量：孕9天組劑量從60-110mg/kg不等，分為若干小組；孕10天組劑量從40-120mg/kg不等，分為若干小組；孕9.5天組劑量分為80和100mg/kg兩個小組。在胚胎16，18，20天(E16，E18，E20)分別剖腹產(chǎn)取出胎鼠，統(tǒng)計總孕鼠數(shù)、總胎鼠數(shù)、MMC胎鼠數(shù)、死胎/吸收胎數(shù)等數(shù)據(jù)。對實驗組，計算MMC率(MMC胎鼠占所有胎鼠的比率)、死胎率(死胎

5、/吸收胎占所有胎鼠的比率)和活胎MMC率(MMC胎鼠占所有活胎的比率)，數(shù)據(jù)用Stata7軟件進行Pearsonx2檢驗，以P≤0.05為有顯著性差異。
　　 2、不同胎齡脊髓脊膜膨出胎鼠膀胱和脊髓神經(jīng)損害的形態(tài)學觀察：胎鼠分為MMC組(灌喂維甲酸后產(chǎn)生MMC的胎鼠)和正常對照組(灌喂橄欖油后產(chǎn)生的正常胎鼠)，每組再根據(jù)胎齡各分3小組，即胚胎16天組(E16)，胚胎18天組(E18)，胚胎20天組(E20)，共6小組。取各組腰骶

6、段脊髓切片，用免疫組織化學法檢測脊髓的GFAP、VAChT的表達；取各組膀胱切片，檢測α-Actin和neurotubulin-β-Ⅲ的表達；另取各組腰骶段脊髓及膀胱切片，作HE染色。Leica Qwin軟件拍攝顯微鏡下照片，Image-Pro Plus5.1軟件分析免疫組化照片相關(guān)部分的光密度，SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行進行統(tǒng)計分析，以P≤0.05為有顯著性差異。
　　 3、不同胎齡脊髓脊膜膨出胎鼠脊髓HGF等細胞因子的R

7、T-PCR檢測：胎鼠分為MMC組(灌喂維甲酸后產(chǎn)生MMC的胎鼠)和正常對照組(灌喂橄欖油后產(chǎn)生的正常胎鼠)，每組再根據(jù)胎齡各分3小組，即胚胎18天組(E18)，胚胎20天組(E20)，胚胎21天組(E21)，共6小組，每組胎鼠數(shù)量為5個。解剖顯微鏡下分離胎鼠標本脊柱，顯微鑷子拆除背側(cè)脊椎，完整取出包括膨出部分的整根脊髓。立即抽提RNA，對肝細胞生長因子(HGF)及受體c-MET和纖溶酶原激活物tPA和uPA以及內(nèi)參基因GAPDH進行反轉(zhuǎn)

8、錄和PCR擴增。獲得的數(shù)據(jù)采用PSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，對分組資料(對照組和MMC組)采用power(2，-△ct)處理數(shù)據(jù)；多組間比較進行ANOVA檢驗分析，兩組間檢驗采用t檢驗(以P值≤0.05為有統(tǒng)計學意義)。
　　 4、組織工程材料大鼠胎仔手術(shù)修補脊膜膨出：孕18天MMC大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，剖腹切開子宮，暴露胎鼠脊膜膨出部位，采用殼聚糖-明膠薄膜以氰基丙烯酸酯粘合劑粘合于脊膜膨出部位，修補脊膜膨出?；丶{胎鼠，

9、修補子宮，關(guān)閉腹腔切口。孕鼠養(yǎng)至孕21天剖宮取出胎鼠。觀察殼聚糖-明膠薄膜覆蓋情況；取出脊髓連續(xù)切片，HE染色；膀胱免疫組化染色，與正常組對照，觀測VACHT和neurotubulin-β-Ⅲ的表達，檢測光密度并行t檢驗。
　　 結(jié)果：
　　 1、維甲酸誘導脊髓脊膜膨出胎鼠動物模型的優(yōu)化：1.孕9天日間灌喂組按維甲酸灌喂劑量分為60、70、80和110mg/kg4個小組，共18只孕鼠，209只胎鼠。各劑量組所得到的MMC

10、胎鼠率都非常低(0-1.92％)，死胎率卻非常高(90.91％-100％)。2.孕10天灌喂組按維甲酸灌喂劑量分為40、50、60、70、80、85、90、100和120rag/kg9個小組，共56只孕鼠，564只胎鼠。劑量為120mg/kg時，胎鼠MMC率最高，為29.95％，活胎MMC率也最高，為38.99％，而死胎率相對較低(23.19％)。3.孕9.5天灌喂組按維甲酸灌喂劑量分為80和100mg/kg2個小組，共41只孕鼠，42

11、3只胎鼠。兩組MMC率分別為31.66％和29.41％，沒有統(tǒng)計學差異；活胎MMC率分別為44.21％和55.56％，也沒有統(tǒng)計學差異；而死胎率80mg/kg組為28.40％，顯著低于100mg/kg組的47.06％(P=0.001)。此外，在80mg/kg組，有一些MMC膨出的范圍較小的胎鼠。
　　 2、不同胎齡脊髓脊膜膨出胎鼠膀胱和脊髓神經(jīng)損害的形態(tài)學觀察：1.在胚胎16天，2組胎鼠的膀胱肌層內(nèi)就已經(jīng)可以檢測出neumtub

12、ulin-β-Ⅲ的表達；胚胎16、18和20天時，MMC組胎鼠膀胱內(nèi)的neurotubulin-β-Ⅲ表達較相同胚胎期的正常對照組顯著降低。2.在胚胎16、18、20天，2組的膀胱肌層內(nèi)都能看到較多的α-Actin的陽性顯色；且各胚胎期，2組膀胱內(nèi)的(α-Actin表達無顯著性差異。3.在胚胎16天和18天，正常組和MMC組及胚胎20天正常組的脊髓內(nèi)，GFAP染色均很少，沒有明顯的星形膠質(zhì)細胞顯示，在胚胎20天的MMC組胎鼠的脊髓背側(cè)，

13、可見大量的GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞顯影，其表達顯著高于正常組。4.MMC組各個胚胎期脊髓VAChT的表達都較少，在胚胎20天組的背外側(cè)核僅見少量陽性表達的神經(jīng)元；而正常組VAChT的表達相對較多，在胚胎20天組的背外側(cè)核可見較多陽性表達的神經(jīng)元；2組間各胚胎期VAChT表達差異均有統(tǒng)計學意義。
　　 3、不同胎齡脊髓脊膜膨出胎鼠脊髓HGF等細胞因子的RT-PCR檢測：1.c-M盯在MMC組較對照組隨胚胎時間增加其表達有增高趨勢

14、，在胚胎21天MMC組較對照組表達升高比18天差異有顯著性。2.c-MET的配體HGF的表達MMC組也隨胚胎時間增加有增高趨勢，在胚胎21天MMC組較對照組表達升高比18和20天差異均有顯著性。3.tPA對照組和MMC組表達無統(tǒng)計學差異，但MMC組均高于對照組。4.uPA在MMC組較對照組隨胚胎時間增加其表達有增高趨勢，在E21天MMC組較對照組表達升高比E18和E20組差異均有顯著性。
　　 4、組織工程材料大鼠胎仔手術(shù)修補脊

15、膜膨出：1-共進行孕鼠手術(shù)85只，麻醉死亡孕鼠10只，成功誘導出脊髓脊膜膨出的孕鼠31只。每只孕鼠僅取1個胎鼠手術(shù)，20只胎鼠順利完成手術(shù)修補操作過程，11只手術(shù)失敗主要為胎鼠溢出子宮，胎盤剝離。20只行脊膜膨出修補手術(shù)完成的胎鼠中7只存活但2只殼聚糖-明膠薄膜脫落。5只修補成功，成功率15.1％(占手術(shù)修補的31只比例)。另13只死亡，死亡率65％。修補脊髓脊膜膨出的胎鼠在孕21天HE染色可以觀察到殼聚糖-明膠薄膜下有皮膚樣細胞長入。

16、膀胱免疫組化染色顯示neurotubulin-β-Ⅲ表達手術(shù)組與正常對照組無差異，與MMC組比較差異有顯著性；VACHT檢測，脊膜膨出修補組與MMC組比較差異無顯著性。
　　 結(jié)論：
　　 1、在本實驗室，孕10天120mg/kg灌喂組、孕9.5天80mg/kg和孕9.5天100mg/kg灌喂組均能取得約30％的MMC率，死胎率前兩者顯著低于后者。孕9.5天80mg/kg灌喂組制模所得胎鼠伴發(fā)其他嚴重畸形相對較少，與臨床

17、病例表現(xiàn)更為接近，可能更適合用于胎兒外科等研究，是較為理想的制模條件。
　　 2、MMC胎鼠胚胎16天至20天膀胱肌層內(nèi)可見神經(jīng)支配，但神經(jīng)纖維減少，這與脊髓內(nèi)骶副交感神經(jīng)核和背外側(cè)核的膽堿能神經(jīng)元減少是同步的，這兩個區(qū)域分別是支配膀胱逼尿肌的盆神經(jīng)和支配尿道外括約肌陰部神經(jīng)的節(jié)前神經(jīng)元分布的區(qū)域。MMC胎鼠膀胱平滑肌的分化和發(fā)育與正常組相比無顯著差別。
　　 3、MMC胎鼠脊髓損傷后的神經(jīng)修復過程，星形膠質(zhì)細胞的出現(xiàn)晚

18、于胚胎18天；在胚胎20天，脊髓的背側(cè)(即MMC突起于羊膜腔的一側(cè))出現(xiàn)大量的星形膠質(zhì)細胞。
　　 4、MMC胎鼠脊髓的HGF及其受體c-MET的RT-PCR檢測提示，HGF及c-MET的表達在胚胎晚期(E21)比早期(E18天)，MMC組較對照組表達升高的差異有顯著性。這一結(jié)果提示HGF和c-MET的表達在MMC組隨胚胎時間增加有增高趨勢。
　　 5、MMC胎鼠脊髓的tPA及uPA的RT-PCR檢測提示，uPA的表達在

19、胚胎晚期(E21)比早期(E18天，E20)，MMC組較對照組表達升高的差異有顯著性，而tPA的表達兩組無明顯差異。這一結(jié)果提示uPA的表達在MMC組隨胚胎時間增加有增高趨勢。
　　 6、胎鼠脊髓脊膜膨出可以采用組織工程材料殼聚糖一明膠薄膜在胎內(nèi)進行修補。孕18天修補脊髓脊膜膨出的胎鼠在孕21天HE染色可以觀察到殼聚糖-明膠薄膜下有皮膚樣細胞長入。膀胱免疫組化染色顯示neurotubulin-β-Ⅲ表達，手術(shù)組與正常對照組無差異