抗膜突蛋白抗體在彌漫性結(jié)締組織病中的研究.pdf

1、彌漫性結(jié)締組織病(CTD)，作為非器官特異性自身免疫性疾病往往具有如下如下特點(diǎn):患者血液中常常出現(xiàn)高滴度的自身抗體和(或)與自身組織成分起反應(yīng)的致敏淋巴細(xì)胞；而患者體內(nèi)產(chǎn)生的自身抗體或致敏淋巴細(xì)胞，與相應(yīng)的自身組織抗原結(jié)合，通過(guò)不同的方式造成組織器官的免疫損傷和功能障礙而致病。因而，結(jié)締組織病自身抗體反應(yīng)的特異性和致病性顯示其在對(duì)該疾病的診斷分類、病情評(píng)估、以及判斷預(yù)后中的價(jià)值。
　　 肺臟受累是CTD常見并發(fā)癥之一，多起病隱襲

2、，早期診斷困難，并且往往治療效果不佳，是導(dǎo)致CTD患者死亡的重要原因之一。其中以肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)和間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease，ILD)為甚，目前已經(jīng)成為風(fēng)濕免疫科和呼吸內(nèi)科醫(yī)師面臨的一大難題。我科既往研究應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CTD-PAH患者的外周血中存在特異性抗78-kDa抗體，并且與患者雷諾現(xiàn)象，較長(zhǎng)病程和PAH嚴(yán)重程度相關(guān)。經(jīng)

3、過(guò)蛋白組學(xué)方法分離鑒定所得特異性抗78-kDa抗體的靶抗原成分為膜突蛋白。并且在細(xì)胞水平證實(shí)人肺血管內(nèi)皮細(xì)胞有膜突蛋白表達(dá)，抗膜突蛋白抗體可能通過(guò)誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞早期凋亡和改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)而引起細(xì)胞損傷。
　　 本項(xiàng)研究首次應(yīng)用重組膜突蛋白作為抗原，建立檢測(cè)患者外周血中抗膜突蛋白抗體的酶聯(lián)免疫分析法和免疫印跡方法，并在大樣本量患者群體中進(jìn)行篩查，結(jié)合患者臨床信息，以期探討抗膜突蛋白抗體檢測(cè)在CTD中的臨床意義。
　　

4、 目的：
　　 1.應(yīng)用原核系統(tǒng)重組、純化、表達(dá)膜突蛋白，并利用該蛋白建立患者外周血抗膜突蛋白抗體檢測(cè)方法。
　　 2.應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析法和免疫印跡法檢測(cè)不同CTD患者外周血中抗膜突蛋白抗體，結(jié)合臨床信息，分析抗膜突蛋白抗體檢測(cè)的臨床意義。
　　 3.應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)SSc患者外周血中抗膜突蛋白抗體，結(jié)合胸部HRCT和肺功能評(píng)估，分析抗膜突蛋白抗體與CTD相關(guān)肺臟受累之間的關(guān)系。
　　 4.應(yīng)用酶聯(lián)

5、免疫分析法檢測(cè)pSS患者外周血中抗膜突蛋白抗體，結(jié)合唾液腺和淚腺功能評(píng)估，分析抗膜突蛋白抗體檢測(cè)在pSS中的臨床意義。
　　 方法
　　 1.應(yīng)用Access軟件分別建立CTD-PAH，SSc患者臨床觀察數(shù)據(jù)庫(kù)，錄入患者臨床資料，同時(shí)收集患者外周血標(biāo)本。
　　 2.根據(jù)膜突蛋白的cDNA進(jìn)行基因重組，在大腸桿菌進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化，并以此為抗原，建立酶聯(lián)免疫吸附法和免疫印跡法檢測(cè)患者血清，同時(shí)對(duì)400例健康受試者群

6、體進(jìn)行篩查，確定本檢測(cè)方法的cut-off值。
　　 3.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法和免疫印跡法對(duì)于SSc，MCTD，SLE，pSS，SV患者外周血進(jìn)行抗膜突蛋白抗體篩查，結(jié)合臨床資料，分析其臨床意義。
　　 4.應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)在形態(tài)學(xué)上觀察pSS患者唇腺組織中膜突蛋白表達(dá)，探索患者外周血中抗膜突蛋白抗體的自身靶抗原。
　　 結(jié)果：
　　 1.應(yīng)用基因重組技術(shù)，在大腸桿菌進(jìn)行膜突蛋白表達(dá)和純化，獲得重組人膜

7、突蛋白，應(yīng)用該抗原建立外周血抗膜突蛋白抗體ELISA檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)400例健康受試者進(jìn)行檢查，確定本方法的參考臨界值為0.158。
　　 2.應(yīng)用抗膜突蛋白抗體ELISA檢測(cè)方法對(duì)于295例CTD患者進(jìn)行抗體篩查結(jié)果示:SSc患者抗膜突蛋白抗體陽(yáng)性率為52.5％，MCTD為39.5％，SLE為51.8％，pSS為69.2％，SV為22.5％，均顯著高于非CTD患者陽(yáng)性率(12.5％)(p<0.001％)。針對(duì)不同臟器受累分析提

8、示:CTD相關(guān)肺臟受累(主要為PAH和ILD)組抗膜突蛋白抗體陽(yáng)性率(57.0％)高于無(wú)肺臟受累組(40.8％)(P=0.018)。比較無(wú)臟器受累CTD組(33)，CTD-ILD組(32)，CTD-PAH組(14)和CTD-ILD&PAH組(14)患者抗膜突蛋白抗體檢測(cè)OD均值提示:CTD-ILD＆PAH組(0.231±0.141)顯著高于其他組(0.120±0.347，0.164±0.064，0.158±0.048，p=0.001)。

9、
　　 3.抗膜突蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性分析顯示:有雷諾現(xiàn)象的CTD患者抗膜突蛋白抗體的陽(yáng)性率(48.6％)高于無(wú)雷諾現(xiàn)象的患者(22.7％)(p=0.025)，抗體檢測(cè)OD均值比較:CTD病程大于五年患者組(0.182±0.109)明顯高于病程小于五年的患者組(0.157±0.069，p=0.050)，CTD合并重度PAH患者組(0.200±0.079)高于輕中度患者(0.158±0.057，p=0.057)。與患

10、者的炎性指標(biāo)及抗UIRNP、抗SSA抗體之間無(wú)明顯相關(guān)性。
　　 4.對(duì)于入組EUSTAR的62例SSc患者進(jìn)行抗膜突蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果顯示:整體陽(yáng)性率為37.7％，根據(jù)胸部HRCT診斷是否合并ILD提示:SSc-ILD患者的陽(yáng)性率為45.2％，明顯高于non-ILDSSc組(9.1％)(P=0.037)。結(jié)合PFT評(píng)估:肺功能受累組抗體OD均值顯著高于無(wú)肺功能受累組。
　　 5.對(duì)于入組SICCA的83例pSS患者進(jìn)行抗

11、膜突蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果顯示:唾液腺和淚腺功能受損組患者的抗膜突蛋白抗體陽(yáng)性率[24(47.1％)和20(44.4％)]明顯高于功能正常組患者[5(22.7％)和5(18.5％)](p=0.050和0.025)，并且抗膜突蛋白抗體與唇腺病理評(píng)分之間顯著相關(guān)。
　　 6.應(yīng)用單克隆抗體證實(shí)正常人唇腺上皮細(xì)胞中有膜突蛋白表達(dá)，并且pSS患者受累唇腺中膜突蛋白表達(dá)上調(diào)。同時(shí)應(yīng)用患者外周血作為一抗證實(shí)抗膜突蛋白抗體的自身靶抗原為該蛋白。

12、r>　　 結(jié)論：
　　 1.外周血ELISA方法檢測(cè)CTD患者抗膜突蛋白抗體陽(yáng)性率顯著高于非CTD患者。
　　 2.CTD不同靶器官受累的患者抗體膜突蛋白抗體陽(yáng)性率不同，合并肺臟受累(主要為PAH和ILD)患者的陽(yáng)性率明顯增高，3.抗膜突蛋白抗體與CTD合并PAH相關(guān)，并可能預(yù)測(cè)PAH病情輕重。
　　 4.抗膜突蛋白抗體并與CTD合并ILD相關(guān)，并可能預(yù)測(cè)ILD病情輕重。
　　 5.pSS患者外周血中抗