抑制GnT-V表達(dá)誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制探討—GLUT1結(jié)構(gòu)和功能異常.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文抑制GnTV表達(dá)誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制探討—GLUT1結(jié)構(gòu)和功能異常姓名：李姣申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：申宗侯20070409抑制GnTV表達(dá)誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制探討—GLUTl結(jié)構(gòu)和功能異常中文摘要N乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶v(GnTV)位于真核細(xì)胞的高爾基體中，它是N連接糖蛋白糖鏈加工合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。GnTV催化的反應(yīng)是將供體UDPGlc

2、NAc中的GlcNAc轉(zhuǎn)移至受體糖鏈中的a1，6甘露糖苷臂，進(jìn)而形成含有D1，6分支結(jié)構(gòu)(GlcNAe[31，6Manctl，6)的三或四天線的N糖鏈。以往的研究顯示，GnTV與正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本課題組前期的研究表明，使用反義寡核苷酸和RNA沉默技術(shù)抑制GnTv的表達(dá)(GnTv的表達(dá)下降約56％)，能夠誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMc7721發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(EndoplasmicReticulumStress，E

3、Rstress)。在轉(zhuǎn)染反義GnTV的7721細(xì)胞(7721／AS)中，分子伴侶Bip在mRNA和蛋白水平均出現(xiàn)增高，同時(shí)出現(xiàn)XBPlmRNA的剪接。總蛋白的糖染色顯示，7721／AS細(xì)胞糖蛋白的三、四天線的N糖鏈明顯減少。但對(duì)于ERstress出現(xiàn)的具體分子機(jī)制還不甚了解，可能與某些糖蛋白的糖鏈變化有關(guān)。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了CmTV低表達(dá)導(dǎo)致7721細(xì)胞出現(xiàn)ERstress的具體分子機(jī)制；繼而從另一側(cè)面初步探討了GI

4、lTV過(guò)表達(dá)時(shí)對(duì)ERstress的影響。本研究分成四部分，以具有N連接糖鏈的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLUTl)為主要研究對(duì)象。首先我們觀察了7721，7721／AS和7721／mock三種細(xì)胞中GLUT的表達(dá)類型，結(jié)果表明GLUTl成為三種細(xì)胞的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體類型。接下來(lái)我們觀察了7721／AS細(xì)胞的GLuTl糖鏈結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化，結(jié)果顯示GLUTl的分子量減小，且三、四天線的N糖鏈成分減少。然后我們又發(fā)現(xiàn)7721／AS細(xì)胞中GLUTl轉(zhuǎn)運(yùn)

5、葡萄糖的功能也顯著降低。進(jìn)一步的研究顯示，GLUTl在7721／AS細(xì)胞中的分布并未受到影響。為了確認(rèn)葡萄糖饑餓可以引起細(xì)胞發(fā)生ER8tl酷S，我們對(duì)7721細(xì)胞進(jìn)行了葡萄糖饑餓的研究，結(jié)果顯示，在葡萄糖饑餓的情況下，7721細(xì)胞發(fā)生了明顯的ERStIfeS$。最后，受文獻(xiàn)的啟發(fā)，我們初步觀察了GnlW表達(dá)水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系：我們以自身存在ERstress的人肝癌細(xì)胞株一HuH7為對(duì)象，發(fā)現(xiàn)與其它自身無(wú)ERstress的肝癌細(xì)胞相比