HCN4在微波輻射致大鼠竇房結損傷中的作用研究.pdf

1、目的和意義:
　　隨著微波技術的飛速發(fā)展和信息時代的來臨,人們在享受便捷生活的同時,也面臨著微波污染的危害。此外,微波技術在軍事上的應用發(fā)展迅速,它不僅能嚴重破壞敵方電子設備,同時也能造成機體損傷。心臟傳導系統(tǒng)是微波輻射敏感的靶標之一,SAN是心臟傳導系統(tǒng)最重要的組成部分。然微波輻射致SAN損傷規(guī)律及量效關系未明,其致傷機制尚未見報道。HCN4可調控P細胞的起搏電流及維持其電生理功能。SAN組織中HCN4的異常表達可能是各種SAN

2、病變發(fā)生的分子基礎之一,而HCN4及其調控可能在微波輻射致大鼠SAN損傷中發(fā)揮重要作用。因此,研究微波輻射致SAN損傷中HCN4的改變、調控及其意義,將為深入研究微波輻射致心臟損傷的分子機制和防治措施提供新靶標和思路,為尋找敏感診斷指標和制定防護標準提供實驗依據(jù)。
　　材料和方法:
　　(1)大鼠SAN定位及組織結構觀察:采用二級Wistar成年大鼠20只,對右心房及與之相連的近段上腔靜脈做水平連續(xù)切片,對切片行HE、Mas

3、son染色,光鏡下觀察連續(xù)切片,定位SAN并觀察組織結構。
　　(2)大鼠SAN超微結構觀察:采用二級雄性Wistar成年大鼠10只,依據(jù)SAN位置、組織結構特點分兩步取材,經樹脂定向包埋,半薄切片甲苯胺藍預染,光鏡下定位后,再行超薄切片,透射電鏡觀察SAN超微結構。
　　(3)微波輻射對大鼠SAN功能和結構的影響研究:采用平均功率密度為0、5、10、50mW/cm2的脈沖微波輻射160只二級雄性Wistar大鼠,輻射時間為

4、6min,于輻射前、輻射后即刻、7d、14d、28d、3m、6m和9m,采用多道生理記錄儀檢測大鼠ECG的變化;于輻射后1d、7d、14d、28d、3m、6m、9m、12m,采用光鏡和電鏡觀察大鼠SAN組織結構和超微結構變化;采用Masson染色、天狼猩紅染色和圖像分析技術,觀察SAN組織膠原纖維含量的動態(tài)變化規(guī)律。
　　(4)微波輻射后大鼠SAN組織HCN4改變及其調控機制研究:采用ISH、IHC和圖像分析等方法,檢測50mW/

5、m2微波輻射后大鼠SAN組織中HCN4及其上游分子β1-AR、M2-AchR基因和/或蛋白的表達變化。
　　(5)微波輻射對原代培養(yǎng)乳鼠SAN細胞的損傷效應及機制研究:以體外原代培養(yǎng)的SAN細胞為研究對象,采用倒置顯微鏡、AFM、LSCM、IF等技術,觀察微波輻射對細胞形態(tài)結構、搏動特征、細胞膜結構、細胞內[Ca2+]及HCN4表達的影響。
　　結果:
　　(1)正常成年大鼠SAN位置和組織學特點:正常成年大鼠SAN位

6、于上腔靜脈與右心耳交界區(qū)及其以上的上腔靜脈壁內,呈馬蹄形/C形;大鼠SAN組織結構疏松,主要含有P細胞、T細胞和少量心房肌細胞,間質膠原纖維含量豐富。
　　(2)正常成年大鼠SAN超微結構觀察:甲苯胺藍預染半薄切片的方法簡便迅速,著色效果好,可有效縮短定位時間。電鏡觀察顯示,大鼠SAN內主要含有兩種細胞。
　?、貾細胞:胞體小,胞漿豐富,細胞器含量少;肌原纖維含量少,雜亂分布于細胞膜附近,幾乎不含肌節(jié);
　　②T細胞:

7、胞體較P細胞大,細胞器含量較多,肌原纖維可見明顯肌節(jié),常沿細胞縱軸排列,分布于細胞膜附近。
　　(3)微波輻射對大鼠SAN功能的影響:5mW/cm2組未見明顯異常;10和50mW/cm2微波輻射后大鼠SAN功能受損,主要表現(xiàn)為:心率呈先加快后減慢趨勢;P波振幅降低;ECG出現(xiàn)竇性心律不齊、SAN內游走性心律和房性心律失常等。
　　(4)微波輻射后大鼠SAN組織結構變化:5mW/cm2組未見明顯異常;10和50mW/cm2微波

8、輻射后1d,表現(xiàn)為P、T細胞水腫;T細胞排列呈波浪狀改變;14~28d損傷最重,表現(xiàn)為細胞排列紊亂,部分細胞胞漿嗜酸性染色增強,核固縮深染;3m~6m損傷減輕呈恢復趨勢,仍有部分細胞呈水腫狀態(tài);9m~12m表現(xiàn)為實質細胞減少,間質膠原纖維增多及脂肪浸潤。以上改變尤以50mW/cm2組最為顯著。
　　(5)微波輻射后大鼠SAN超微結構變化:5mW/cm2組未見明顯異常;10和50mW/cm2微波輻射后1d~28d表現(xiàn)為P、T細胞線粒

9、體最早受累,出現(xiàn)腫脹,嵴斷裂,甚至空化;肌原纖維局灶性溶解、斷裂;可見P、T細胞核染色質濃縮、邊集;細胞膜小凹減少或消失;血管周圍間隙增寬、水腫;6m~12m表現(xiàn)為實質細胞退行性變,間質膠原原纖維增多、脂肪浸潤。以上改變尤以50mW/cm2組最為顯著。
　　(6)微波輻射致大鼠SAN損傷后HCN4、β1-AR、M2-AchR變化:50mW/cm2微波輻射后1d~28d,大鼠SAN組織中HCN4mRNA表達上調(P<0.05或P<0

10、.01),3m表達下調(P<0.05);HCN4蛋白于輻射后1d~28d表達增加(P<0.05或P<0.01),3m~6m表達降低(P<0.05);β1-ARmRNA于輻射后1d~3m表達上調(P<0.05或P<0.01);β1-AR蛋白于輻射后1d~3m表達增加(P<0.05或P<0.01);M2-AchR蛋白于輻射后1d~6m表達增加(P<0.05或P<0.01)。
　　(7)微波輻射后體外培養(yǎng)SAN細胞形態(tài)結構、搏動特征變化

11、:正常SAN細胞呈長梭形,伸出偽足或突起與周圍細胞連接成片,呈單個細胞搏動,搏動速度快,節(jié)律規(guī)則。10和50mW/cm2微波輻射后,SAN細胞搏動明顯減慢且節(jié)律不規(guī)則,細胞腫脹變圓,偽足和突起減少。50mW/cm2微波輻射后即刻SAN細胞內[Ca2+]升高(P<0.05),細胞膜表面可見穿孔現(xiàn)象。
　　(8)微波輻射致體外培養(yǎng)SAN細胞損傷后HCN4表達改變:50mW/cm2微波輻射后即刻,SAN細胞中HCN4蛋白表達顯著減弱(P

12、<0.01),12h表達顯著增強(P<0.05)。
　　結論:
　　(1)成年大鼠SAN特殊的位置提示:大鼠SAN取材時一定要保留上腔靜脈近心段;兩步法前固定取材有助于大鼠SAN電鏡標本的制作。
　　(2)10、50mW/cm2微波輻射導致大鼠SAN功能障礙、組織結構和超微結構損傷,上述改變與微波輻射劑量呈正相關。
　　(3)10、50mW/cm2微波輻射可導致培養(yǎng)的SAN細胞形態(tài)結構損傷和搏動下降,且與微波輻射