防御素5與修飾GLP2多基因表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)復(fù)合傷腸源性感染防治的.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文防御素5與修飾GLP2多基因表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)復(fù)合傷腸源性感染防治的姓名：譚虎申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：@指導(dǎo)教師：楊天德20040501第三軍醫(yī)大學(xué)碩士論文 第 頁(yè) 結(jié)果1 通過 RT- PCR 方法 從癲癇患者的腦組織總 RNA 中獲得高血糖素原基因序列測(cè)序結(jié)果顯示序列完全正確2 通過 PCR 重組技術(shù) 獲得了 HD-5 的目的基因片段 測(cè)序結(jié)果顯示已成功將信號(hào)肽和成熟肽序列拼接起來 并加入了 Lox- P 序列

2、 GLP- 2 也得到了相同結(jié)果 而且編碼其成熟肽 N- 末端第二位氨基酸的序列已由丙氨酸(GCT)突變?yōu)楦拾彼?GGT)提示定點(diǎn)突變成功3 重組表達(dá)質(zhì)粒 pVITRO3-HD5-GLP2 酶切分析提示插入片段方向正確 測(cè)序結(jié)果顯示序列完全正確 可用于下一步的基因治療實(shí)驗(yàn)4 腸上皮細(xì)胞 Caco- 2 進(jìn)行重組質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后RT- PCR 顯示陽(yáng)性克隆中有HD- 5 和 GLP-2 mRNA 的表達(dá) 提示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并得到成功轉(zhuǎn)

3、錄 MTT 證實(shí)含rGLP- 2 的培養(yǎng)上清可明顯促進(jìn) Caco- 2 細(xì)胞增殖5 殼聚糖形成的納米粒大小均勻 DNA 包封率高 能有效抵抗 DNA 酶 I 降解介導(dǎo) pEGFP 基因轉(zhuǎn)移后 通過熒光顯微鏡能觀察到有綠色熒光蛋白產(chǎn)生 但表達(dá)量低于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)照組6 口服重組質(zhì)粒殼聚糖納米粒后 RT- PCR 方法檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)小鼠腸上皮組織有HD- 5 和 GLP-2 mRNA 的表達(dá) 光學(xué)顯微鏡 掃描電鏡及電子顯微鏡均提示 重組質(zhì)粒治療組

4、的腸上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)修復(fù)較對(duì)照組明顯提前 表現(xiàn)為絨毛高度增加 密度增加排列整齊 各細(xì)胞器損傷明顯減輕 移位細(xì)菌及內(nèi)毒素檢測(cè)提示移位至淋巴結(jié) 肝血中的細(xì)菌明顯減少 血漿內(nèi)毒素濃度明顯降低 而加用氯胺酮對(duì)該治療效應(yīng)無明顯影響結(jié)論1 通過PCR重組技術(shù)可以成功地將編碼信號(hào)肽和成熟肽的序列拼接起來 適用于分泌性載體的構(gòu)建2 雙順反子構(gòu)建的多基因表達(dá)質(zhì)粒可成功攜帶多個(gè)基因并能同時(shí)高效表達(dá) 適用于多基因表達(dá)策略3 殼聚糖納米?？捎糜诮?jīng)口服途徑的腸道基因