腦橋呼吸調(diào)整中樞對(duì)黑伯反射和低氧呼吸反應(yīng)的調(diào)控作用.pdf

1、腦橋呼吸調(diào)整中樞由腦橋背外側(cè)(d1-pons)和腦橋腹外側(cè)(v1-pons)兩個(gè)結(jié)構(gòu)組成。D1-pons的主要結(jié)構(gòu)即KF核及臂旁核(PB)，v1-pons則主要是指A5區(qū)。D1-pons和v1-pons之間存在雙向纖維聯(lián)系。眾所周知，腦橋是呼吸調(diào)整中樞所在地，在呼吸節(jié)律的發(fā)起、呼吸時(shí)相轉(zhuǎn)換以及呼吸運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)中發(fā)揮重要作用。本課題試圖通過研究腦橋呼吸調(diào)整中樞對(duì)呼吸反射的調(diào)節(jié)作用探討腦橋呼吸運(yùn)動(dòng)調(diào)控機(jī)制。研究分為五部分：第一部分觀察了某些神經(jīng)

2、遞質(zhì)拮抗劑在d1-pons及v1-pons對(duì)黑伯反射(肺牽張反射)的影響；第二部分觀察了它們?cè)赿1-pons及v1-pons對(duì)低氧呼吸反應(yīng)的影響；第三部分應(yīng)用神經(jīng)纖維投射追蹤和免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察了d1-pons和v1-pons神經(jīng)元向腦干呼吸反射(低氧呼吸反應(yīng)和黑伯反射)相關(guān)神經(jīng)元的軸突投射；第四部分觀察了小鼠的黑伯反射，并觀察了NMDA受體對(duì)小鼠黑伯反射的影響；第五部分觀察了電刺激v1-pons對(duì)黑伯反射的調(diào)控及NMDA受體在該過程

3、中的作用。 1、NMDA、GABA及AMPA受體拮抗劑在d1-pons及v1-pons對(duì)黑伯反射的影響實(shí)驗(yàn)在35只成年SD大鼠上進(jìn)行，氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，巴夫龍(pancuronium bromide)肌松，人工通氣。以膈神經(jīng)放電為觀察指標(biāo)。電刺激迷走神經(jīng)模擬黑伯反射。電刺激參數(shù)為：強(qiáng)度20-80μA，頻率80 Hz，波寬0.1 ms，刺激時(shí)間60 sec。持續(xù)電刺激迷走神經(jīng)首先出現(xiàn)的是強(qiáng)度依賴性的呼吸暫停、膈神經(jīng)放電停止

4、于呼氣相(Srage-1)。隨著刺激的延續(xù)，節(jié)律性膈神經(jīng)放電重新出現(xiàn)，呼吸頻率逐漸加快向基線水平恢復(fù)仍然低于基線水平(Stage-2)。刺激停止后出現(xiàn)短暫的呼吸頻率加快并高于刺激前基線水平，該現(xiàn)象主要是由呼氣時(shí)間的縮短引起的，稱為刺激后反跳效應(yīng)(PR，Stage-3)。分別在d1-pons及v1-pons微量注射NMDA受體阻斷劑D-2-氨基-5-膦酸基戊酸(D-AP5，10 mM)、GABA受體阻斷劑荷包牡丹堿(bicuculline

5、，BIC，5 mM)及AMPA受體阻斷劑CNQX(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2，3-dione，10 mM)，注射劑量20-50 nl。以注射前黑伯反射為前對(duì)照，觀察注射后黑伯反射的改變。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)在dl-pons微量注射AP5可以增強(qiáng)黑伯反射的呼吸抑制效應(yīng)，表現(xiàn)為黑伯反射第一第二階段呼吸頻率下降幅度、呼氣時(shí)間延長(zhǎng)幅度及吸氣時(shí)間縮短幅度均增大；黑伯反射第三階段呼吸頻率仍然低于基線水平，反跳現(xiàn)象

6、消失，該階段吸氣時(shí)間增加的幅度明顯增大，上述變化均有顯著性差異。(2)在vl-pons微量注射AP5可以削弱黑伯反射的呼吸抑制效應(yīng)，表現(xiàn)為黑伯反射第一第二階段呼吸頻率下降幅度、呼氣時(shí)間延長(zhǎng)幅度均減小，黑伯反射第三階段呼吸頻率高于基線水平出現(xiàn)反跳現(xiàn)象，但比前對(duì)照削弱，上述變化均有顯著性差異。(3)在dl-pons微量注射BIC可以削弱黑伯反射的呼吸抑制效應(yīng)，表現(xiàn)為黑伯反射第一階段呼吸頻率下降幅度、呼氣時(shí)間延長(zhǎng)幅度及吸氣時(shí)間縮短幅度均減小，

7、第二階段呼氣時(shí)間延長(zhǎng)幅度及吸氣時(shí)間縮短幅度也減小，第三階段呼氣時(shí)間縮短的幅度減小，吸氣時(shí)間雖比第二階段有所延長(zhǎng)但仍低于基線水平，上述變化均有顯著性差異。第三階段呼吸頻率高于基線水平，出現(xiàn)反跳現(xiàn)象，與前對(duì)照相比有所削弱但無顯著性差異。(4)在vl-pons微量注射BIC可以增強(qiáng)黑伯反射的呼吸抑制效應(yīng)，表現(xiàn)為黑伯反射第一第二階段呼吸頻率下降幅度、呼氣時(shí)間延長(zhǎng)幅度及吸氣時(shí)間縮短幅度均增大，變化均有顯著性差異；黑伯反射第三階段呼吸頻率高于基線水

8、平，出現(xiàn)反跳現(xiàn)象，與前對(duì)照相比有所削弱但無顯著性差異。(5)在dl-pons微量注射AMPA受體阻斷劑CNQX后，黑伯反射三個(gè)階段的膈神經(jīng)放電抑制效應(yīng)無明顯變化；(6)在vl-pons微量注射CNQX后，黑伯反射三個(gè)階段的膈神經(jīng)放電抑制效應(yīng)也沒有顯著改變。這些結(jié)果表明存在于dl-pons及vl-pons的由NMDA受體及GABA受體介導(dǎo)的突觸傳遞參與了對(duì)黑伯反射強(qiáng)度的調(diào)節(jié)，AMPA受體不影響該過程。 2、NMDA、GABAA及A

9、MPA受體拮抗劑在dl-pons及vl-pons對(duì)低氧呼吸反應(yīng)的影響實(shí)驗(yàn)在35只成年SD大鼠上進(jìn)行。動(dòng)物制備同前。低氧通氣為8％O2-92％N2混合氣體，低氧通氣時(shí)間30-50秒。以膈神經(jīng)放電為觀察指標(biāo)，分別向dl-pons及vl-pons內(nèi)微量注射NMDA受體阻斷劑D-AP5、GABA受體阻斷劑BIC、AMPA受體阻斷劑CNQX，觀察注射前后低氧通氣時(shí)膈神經(jīng)放電的變化。結(jié)果顯示給予大鼠低氧刺激后，膈神經(jīng)放電首先出現(xiàn)頻率升高、吸氣相幅度

10、增大、呼氣時(shí)間及吸氣時(shí)間均縮短，此謂急性低氧呼吸反應(yīng)。終止低氧恢復(fù)正常通氣后即可出現(xiàn)膈神經(jīng)放電頻率降低并低于低氧刺激前基線水平，此現(xiàn)象稱為低氧后呼吸頻率下降(PHFD)。以微量注射前低氧反應(yīng)為前對(duì)照，(1)在dl-pons微量注射D-AP5后，急性低氧反應(yīng)膈神經(jīng)放電無顯著性改變，但PHFD期膈神經(jīng)放電頻率下降幅度減小，即PHFD現(xiàn)象被削弱。(2)在vl-pons微量注射D-AP5后，急性低氧反應(yīng)期及PHFD期膈神經(jīng)放電均無顯著性改變。(

11、3)在dl-pons微量注射BIC后，急性低氧反應(yīng)期膈神經(jīng)放電頻率升高的幅度及呼氣時(shí)間縮短的幅度均增大，PHFD期膈神經(jīng)放電無顯著性變化。(4)在vl-pons微量注射BIC后，急性低氧反應(yīng)期膈神經(jīng)放電無顯著性變化，但PHFD期呼吸頻率下降幅度減小。(5)在dl-pons微量注射CNQX后，急性低氧反應(yīng)期膈神經(jīng)放電頻率無明顯變化，但呼氣時(shí)間縮短的幅度減小，吸氣時(shí)間縮短的幅度增大。PHFD期膈神經(jīng)放電頻率降低的幅度減小。(6)在vl-po

12、ns內(nèi)微量注射CNQX后，急性低氧反應(yīng)期吸氣時(shí)間縮短的幅度增大，但膈神經(jīng)放電頻率及呼氣時(shí)間均無顯著性變化。PHFD期膈神經(jīng)放電頻率降低的幅度減小。這些結(jié)果表明dl-pons NMDA受體、GABA受體及AMPA受體均參與了對(duì)低氧呼吸反應(yīng)的調(diào)節(jié)，NMDA受體主要影響低氧后呼吸頻率下降，GABA受體主要影響急性低氧反應(yīng)，dl-pons AMPA受體作用則表較復(fù)雜，它既影響急性低氧反應(yīng)又影響低氧后呼吸頻率下降。vl-pons GABA受體及A

13、MPA受體參與了低氧呼吸反應(yīng)的調(diào)節(jié)，GABA受體主要影響低氧后呼吸頻率下降，AMPA受體既影響急性低氧反應(yīng)又影響低氧后呼吸頻率下降，NMDA受體沒有參與該反應(yīng)的調(diào)節(jié)。 3、Vl-pons與延髓外周化學(xué)感受性反射及黑伯反射功能相關(guān)神經(jīng)元之間的纖維聯(lián)系實(shí)驗(yàn)在8只成年SD大鼠上進(jìn)行。腹腔注射苯巴比妥(50 mg/kg)麻醉。在無菌手術(shù)條件下應(yīng)用壓力注射或微電泳方法向d1-pons KF核內(nèi)微量注射Biotin dextran，壓力注射

14、量為20-30 nl(10％)。微電泳注射采用陽極直流電，5μA，15-30分鐘。動(dòng)物存活10天后給予動(dòng)物8％的低氧刺激或呼氣末正壓通氣刺激(PEEP)。2-3小時(shí)后，腹腔注射氨基甲酸乙酯將動(dòng)物麻醉，左心室插管灌流、固定，取腦干切片(50μm)，用兔抗c-Fos多克隆抗體(一抗)及結(jié)合生物素的羊抗兔IgG(二抗)培育腦片，再用ABC-DAB方法處理腦片，用甲酚紫染色方法染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)自d1-pons KF核的纖維投射到已知的延髓呼吸相

15、關(guān)結(jié)構(gòu)。另外單纖維追蹤顯示KF核神經(jīng)元支配多個(gè)結(jié)構(gòu)。c-Fos免疫陽性神經(jīng)元主要分布在孤束核內(nèi)側(cè)及腹外側(cè)亞核、延髓腹外側(cè)的外側(cè)網(wǎng)狀核、疑核及其周圍區(qū)域。發(fā)自d1-pons的標(biāo)記纖維末梢與上述c-Fos免疫陽性神經(jīng)元集中存在的區(qū)域重疊，提示d1-pons投射纖維與延髓中參與外周化學(xué)感受器反射及黑伯反射的神經(jīng)元可能存在突觸聯(lián)系。 4、普通野生型及MECP2基因敲除小鼠黑伯反射特點(diǎn)及NMDA受體對(duì)其調(diào)節(jié)作用雷特氏綜合癥(Rett綜合癥)是一種

16、嚴(yán)重影響兒童精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，兒童在6到18個(gè)月表現(xiàn)正常，隨后病童會(huì)有快速退化及發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，并出現(xiàn)陣發(fā)喘氣等呼吸異?，F(xiàn)象，大約26％的Rett綜合癥患者死于呼吸功能紊亂。研究發(fā)現(xiàn)該病可能與methy1-CpG結(jié)合蛋白2(MECP2)基因的突變有關(guān)。 5、電刺激dl-pons及向vl-pons內(nèi)微量注射NMDA受體阻斷劑MK-801對(duì)黑伯反射的調(diào)控作用該部分實(shí)驗(yàn)在38只成年Wistar大鼠上進(jìn)行，雌雄不拘。氨基甲酸乙

17、酯腹腔麻醉，用三碘季銨酚肌松，人工通氣，以膈神經(jīng)放電為觀察指標(biāo)。電刺激迷走神經(jīng)模擬黑伯反射。Vl-pons電刺激參數(shù)：50-80 μA，80 Hz，波寬0.3 ms，刺激時(shí)間20 sec，迷走神經(jīng)電刺激參數(shù)：20-40 μA(1.5×閾值)，80 Hz，波寬0.1 msec，刺激時(shí)間60 sec。以電刺激vl-pons之前的黑伯反射為前對(duì)照，電刺激vl-pons后5 sec內(nèi)再次電刺激迷走神經(jīng)引導(dǎo)出黑伯反射，發(fā)現(xiàn)與前對(duì)照相比，黑伯反射的