復合VEGF基因和EPC的膀胱無細胞基質(zhì)構(gòu)建組織工程膀胱的研究.pdf

1、目的：膀胱無細胞基質(zhì)(BAM)可以作為支架允許組織再生以實現(xiàn)膀胱擴大和重建。但單純采用無細胞基質(zhì)存在移植物攣縮的問題，顯示單純的無細胞基質(zhì)誘導組織再生能力不足。無細胞基質(zhì)本身無營養(yǎng)來源，因此，其植入體內(nèi)后快速的血管再生對于整個組織的再生具有重要意義。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和外周血內(nèi)皮祖細胞(EPC)具有促血管生成作用，有助于組織再生。本研究采用含VEGF基因的腺病毒轉(zhuǎn)染自體外周血EPC后種植于同種異體膀胱無細胞基質(zhì)，以該無細胞基質(zhì)

2、進行膀胱替代，以期植入的EPC和其旁分泌的VEGF促進血管新生，有利于誘導膀胱再生，為獲得來源簡便、更為理想的膀胱替代材料開辟新的途徑。 方法：采用密度梯度離心法分離小型豬外周血，培養(yǎng)、擴增所得到的內(nèi)皮祖細胞，應(yīng)用免疫細胞化學、透射電子顯微鏡和RT-PCR方法進行鑒定。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測細胞表面特異性的標記CD133、CD34、CD117、CD44、CD45、CD31、CD144、VEGFR-2。應(yīng)用Dil-acLDL吞噬實驗和

3、Matrigel實驗來評價內(nèi)皮祖細胞的功能。構(gòu)建含VEGF基因的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞，免疫細胞化學、RT-PCR和ELISA方法檢測VEGF基因的表達。制備豬膀胱無細胞基質(zhì)，HE染色、Masson染色和掃描電鏡方法檢查膀胱無細胞基質(zhì)的特性，同時應(yīng)用生物力學方法檢查膀胱無細胞基質(zhì)的力學性質(zhì)。隨后VEGF基因修飾的EPC復合于膀胱無細胞基質(zhì)上，體外培養(yǎng)3天，然后回植動物體內(nèi)構(gòu)建組織工程膀胱以進行膀胱擴大。以單純膀胱無細胞基質(zhì)的替

4、代作為對照。每組各6只實驗動物。在術(shù)后的1個月、3個月和6個月分別檢查膀胱功能，并處死實驗動物，進行組織學分析和免疫組織化學染色，計算新生微血管的密度。 結(jié)果：成功由小型豬外周血分離培養(yǎng)得到內(nèi)皮祖細胞，并進行鑒定。細胞的表面標記分別為CD13325.1％、CD3415.0％、CD11755.9％、CD4498.4％、CD454.5％、CD3182.0％、CD14495.4％、VEGFR-297.7％。含VEGF基因的腺病毒載體的

5、轉(zhuǎn)染效率超過60-70％。轉(zhuǎn)染后的EPC同時表達VEGF蛋白和綠色熒光蛋白。Masson染色和掃描電鏡觀察表明細胞粘附于膀胱無細胞基質(zhì)表面，并在其上增殖和生長。證明膀胱無細胞基質(zhì)對EPC無細胞毒性。組織工程膀胱的功能和組織學檢查表明膀胱組織隨時間逐漸再生。新生微血管密度的計量表明復合細胞組的血管密度增加明顯。 結(jié)論：EPC經(jīng)VEGF基因修飾后可以作為種子細胞，膀胱無細胞基質(zhì)可以作為支架材料來構(gòu)建組織工程膀胱。VEGF基因修飾后的