淫羊藿苷和鹽酸小檗堿通過改變肝臟Hepcidin表達調節(jié)鐵平衡.pdf

1、鐵是人體中必不可少的微量元素，它參與DNA的合成，蛋白質的形成，氧的運輸和能量代謝等活動，而維持體內鐵平衡具有至關重要的作用，其中，hepcidin-ferroportin軸從根本上負責調節(jié)鐵的供應，利用，回收和儲存，而鐵調素（hepcidin）的缺乏會使膳食中鐵的吸收和巨噬細胞鐵釋放增強，導致在血清和器官中出現(xiàn)過量的鐵，鐵的過量與這些器官的發(fā)病率密切相關。鐵調素(hepcidin)的減少已經被證明與一些類型的遺傳性血色素沉著癥(HH)

2、和β-地中海貧血有著密切的關系，提高hepcidin這種治療方法已經被提出并用于治療由于鐵過載所導致的這些疾病。在傳統(tǒng)中醫(yī)治療中，許多中草藥已被用于治療或者改善這些疾病，眾所周知的，一些中藥具有補血養(yǎng)血或者活血化瘀的作用，而這些作用是否是由于影響和調節(jié)hepcidin的表達所引起的尚不清楚，但卻是一個值得研究的可能性。而且，到目前為止，從傳統(tǒng)中草藥中提取的天然化合物并沒有被用于做相關的研究。
　　在我們的研究中，我們的目的是篩選用

3、于治療由于基因突變或缺失導致低Hepcidin和鐵負荷疾病的天然化合物。在研究中，我們用啟動子雙熒光素酶報告質粒和實時定量PCR兩種方法來檢測鐵調素(hepcidin)基因的表達，并月動物模型來驗證，從而研究14從傳統(tǒng)中草藥中純植物提取的天然化合物對hepcidin表達的影響。經過我們的反復篩選和驗證，證明淫羊藿苷和鹽酸小檗堿這兩種天然化合物對肝細胞中hepcidin轉錄及表達產生一個強有力的刺激作用，進一步研究機制研究表明，淫羊藿苷和

4、鹽酸小檗堿對肝細胞hepcidin的表達的增強作用是通過激活Stat3和Smad1/5/8這兩條主要影響hepcidin表達的信號通路完成的。體內實驗研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能增強ICR小鼠肝臟hepcidin的轉錄及表達從而影響血清和組織中的鐵含量的變化作用得到證實，然而，淫羊藿苷對小鼠體內鐵含量變化的影響在Hepcidin缺乏(Hamp1-/-)的小鼠中并沒有出現(xiàn)，從而進一步證明了淫羊藿苷產生作用的靶點為肝臟中的hepcidin。總而言之

5、，淫羊藿苷和鹽酸小檗堿在誘導肝臟產生hepcidin的作用中表現(xiàn)出強大的功效，而這些hepcidin可以用來抑制膳食中鐵的吸收和促進鐵代謝進入循環(huán)從而減輕鐵負荷。這項研究表明某些天然化合物在治療鐵失調疾病中有很大的應用潛力，即可以通過調節(jié)肝臟hepcidin表達來治療鐵失調所產生的疾病。
　　本課題研究包括以下兩部分:文獻綜述和實驗研究。
　　1文獻綜述:本部分從“鐵代謝及其影響機制、相關疾病和傳統(tǒng)中藥的治療”進行綜述。

6、r>　　2實驗研究:包括以下五個部分。
　　研究一篩選影響hepcidin表達的中藥單體的干預效應研究。
　　目的:從14種中藥單體中篩選對hepcidin表達有影響的中藥單體。
　　方法:我們使用熒光素酶標記的方法進行篩選，這種方法是在我們的研究小組開發(fā)的，即構建人hepcidin上游的啟動子片段(1.6 kb)的螢火蟲熒光素酶基因。在篩選試驗進行在兩種肝癌細胞即小鼠的Hepa1-6細胞和人的HepG2細胞中同時進行

7、的。篩選前，藥物毒性是評估通過MTT法進行的，這些天然化合物在濃度不到100μm的時候沒有任何細胞毒性，以淫羊藿苷為代表，我們在初始濃度篩選試驗中選擇使用濃度5μm這個濃度，各個中藥單體在這個濃度下對細胞活性都沒有造成損傷。
　　結果:藥物處理后24 h，hepcidin-熒光素酶活性被檢測。在HepG2細胞中觀察到相對于對照組，桔丙酯，白藜蘆醇，胡黃連苷Ⅱ，小檗堿，淫羊藿苷，土大黃苷和漢黃芩素7組約2倍增加的hepcidin的熒

8、光素酶活性(P＜0.05)，在HepG2細胞中相對于對照組鹽酸川芎嗪和黃芪甲苷、甘草苷、人參皂苷Rb1這3組發(fā)現(xiàn)hepcidin的熒光素酶報告基因活性增加了約50％(P＜0.05)，然而，姜黃素，芍藥苷和阿魏酸未能顯著改變hepcidin的熒光素酶活性(P＞0.05)。在Hepa1-6細胞中，相對于對照組，淫羊藿苷，鹽酸小檗堿，胡黃連素Ⅱ，土大黃素和漢黃芩素約2倍的促進hepcidin的熒光素酶活性(P＜0.05)，這個結果與在人的肝癌

9、細胞即HepG2細胞是一致的。在Hepa1-6細胞中，相對于對照組，阿魏酸、甘草苷、人參皂苷Rb1能刺激hepcidin的熒光素酶的活性增加約50％(P＜0.05)，其他中藥單體包括白藜蘆醇、桔丙酯、黃芪甲苷、芍藥苷、鹽酸川芎嗪和姜黃素，在Hepa1-6細胞中與對照組相比沒有顯著改變hepcidin的熒光素酶活性(P＞0.05)。
　　結論:胡黃連苷Ⅱ;小檗堿;淫羊藿苷;土大黃苷和漢黃芩素這5種不中藥單體能同時增加在人肝癌細胞He

10、pG2和鼠肝癌細胞Hepa1-6細胞中hepcidin的表達。
　　研究二進一步用qRT-PCR的方法驗證所篩選的中藥單體的效應研究。
　　目的:為了進一步驗證上述的篩選出的中藥單體對hepcidin表達的影響作用，即是否影響hepcidin內源性表達及可能的劑量依賴的效應。
　　方法:我們用了實時熒光定量PCR的方法來測定這些中藥單體對細胞的hepcidinmRNA水平影響，我們選擇了上述實驗篩選出的淫羊藿苷，鹽酸小

11、檗堿，胡黃連素Ⅱ和土大黃素進一步研究。我們使用制造商提供的說明書進行細胞總RNA的提?。↖nvitrogen公司），mRNA的表達水平的探討通過qRT-PCR分析使用2×濃縮的實時定量PCR擴增的預混和溶液（SYBR Green qPCR master mix，Qiagen公司）。引物序列如下:人HAMP，上游:5'-CCTGACCAGTGGCTCTGTTT-3'，下游:5'-CACATCCCACACTTTGATCG-3';人 GAPD

12、H,上游:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'，下游:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3';鼠HAMP，上游:5'-CTGAGCAGCACCACCTATCTC-3'，下游:5'-TGGCTCTAGGCTATGTTTTGC-3';鼠GAPDH，上游:5'-AAGGT℃ATCCCAGAGCTG，下游:5'-GCCATGAGGTCCACCACCCT-3';GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是用來作為一個管家基因用

13、來標準化相對的基因表達。
　　結果:通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷，鹽酸小檗堿，胡黃連素Ⅱ和土大黃素這4種中藥單體具有顯著提高hepcidin的熒光素酶活性的作用，然而，在HepG2細胞中只有淫羊藿苷，鹽酸小檗堿，與土大黃苷被證明與對照組相比顯著（約2倍）的提高了細胞內源性hepcidin表達的作用(P＜0.05)，此外，在Hepa1-6細胞中，淫羊藿苷和鹽酸小檗堿也被證明與對照組相比超過2倍的增加細胞內源性hepcidin表達(

14、P＜0.05)，這些數據表明，淫羊藿苷和鹽酸小檗堿誘導肝臟hepcidin表達能力最強。接下來，我們進一步驗證了淫羊藿苷和小檗堿對hepcidin表達的激活作用是否存在劑量依賴的效應。在HepG2細胞中，淫羊藿苷在5μM的濃度下與對照組相比約2倍增加細胞中hepcidin表達，在20μM和50μM兩個濃度下，對照組相比約3倍增加細胞中hepcidin表達(P＜0.05)。同樣，在Hepa0-6細胞中淫羊藿苷從5μM到50μM誘導hepc

15、idin的表達也存在劑量依賴效應，與對照組相比在50μM時約3倍的最大增加(P＜0.05)。與淫羊藿苷相反，鹽酸小檗堿的劑量依賴效應并不明顯，它在5μM和50μM兩個濃度對HepG2細胞中hepcidin的表達的與對照組相比均大于3倍(P＜0.05):類似于HepG2細胞，鹽酸小檗堿在5μM和50μM兩個濃度對Hepa0-6細胞中hepcidin表達與對照組相比升高約有4倍(P＜0.05)，說明鹽酸小檗堿在5μM濃度下就能達到最大活性并

16、刺激hepcidin的表達。因此，我們選擇淫羊藿苷和鹽酸小檗堿進行接下來的研究。
　　結論:淫羊藿苷和鹽酸小檗堿素進一步通過實時熒光定量PCR結果表明對細胞hepcidin表達具有刺激作用，因此，我們選擇這兩個中藥單體進行進一步的詳細研究。
　　研究三探索淫羊藿苷和鹽酸小檗堿調節(jié)hepcidin表達的機制研究。
　　目的:為了了解淫羊藿苷和鹽酸小檗堿促進hepcidin表達的分子基礎，我們研究了參與Hepcidin表達

17、調節(jié)的信號通路。
　　方法:我們使用Western blot的方法。即兩種中藥單體作用于細胞后，細胞在冷的PBS收獲，總蛋白用RIPA裂解液提?。⊿olarbio，中國）并添加蛋白酶抑制劑(Roche)。對每個樣品的蛋白裂解液等量進行SDS-PAGE并按照標準程序進行Westem blot分析。主要抗體如下，抗-pSmad1/5/8抗體(1∶1000; Santa cruzeBiotechnology)，抗-Smadl抗體(1∶1

18、000; Santa cruze Biotechnology)，抗-pStat3抗體(1∶1000; Cell Signaling Technology)，抗-Stat3抗體(1∶1000; Cell SignalingTechnology)和抗-GAPDH抗體(1∶2000; Sigma-Aldrich)。
　　結果:雖然影響hepcidin的調節(jié)的信號通路比較復雜的，但是有兩個信號通路被認為在正常條件下主要調控hepcidin

19、的表達，即Stat3通路和Smad1/5/8通路。這兩個通路中一個或兩個被激活，hepcidin表達可通過抑制膳食鐵的吸收和巨噬細胞合成而增多。因此，我們研究了淫羊藿苷和鹽酸小檗堿作用于HepG2細胞后Stat3通路和Smad1/5/8通路是否被激活。我們觀察到淫羊藿苷作用后Stat3磷酸化水平與對照組相比明顯增加，特別是在50μM濃度下。同時，觀察到淫羊藿苷作用后磷酸化Smad1/5/8的水平也是增加的，尤其是50μM。這些觀察結果表

20、明，淫羊藿苷通過激活Stat3和Smad1/5/8通路增加hepcidin表達，此外，在較高濃度的淫羊藿苷（5μm）比低濃度的能力（在5μm)對Stat3和Smad1/5/8信號通路具有更大的激活作用，hepcidin表達在高濃度也增加更多。類似于淫羊藿苷，鹽酸小檗堿也被證明能激活Stat3信號通路和Smad1/5/8通路，通過顯著增加磷酸化Stat3和磷酸化Smad1/5/8證明。鹽酸小檗堿在5μM或50μM兩個濃度對磷酸化Smad1

21、/5/8的增加程度是相似的，這與鹽酸小檗堿對hepcidin誘導的變化在5μM或50μM一致。應該指出的是，通過Westem印跡分析證明淫羊藿苷鹽酸小檗堿不改變總Stat3和Smad1的表達水平。
　　結論:這些結果表明，淫羊藿苷和鹽酸小檗堿是由于激活Stat3和Smad1/5/8的兩條信號通而促進hepcidin的表達，這兩個信號通路共同促進肝細胞hepcidin表達并響應于淫羊藿苷和鹽酸小檗堿作用。
　　研究四淫羊藿苷對

22、小鼠體內肝臟hepcidin表達影響的效應研究。
　　目的:為了驗證淫羊藿苷的刺激作用，并進一步進行動物研究。
　　方法:野生型(WT) ICR小鼠隨機分組，每組8只小鼠(n=8)。淫羊藿苷在小鼠腹腔注射的劑量為100mg/kg，對照組小鼠接受PBS與相應濃度的DMSO。對于急性處理，小鼠在給藥后6h或48h后處死。對于慢性處理，小鼠分別在給藥后的2d、4d、8d和16d處死小鼠。收集血液，并為每個小鼠肝臟和脾臟標本分離和稱

23、重，一小塊肝標本快速冷凍在液氮中，然后保存在-80℃供RNA提取。
　　結果:淫羊藿苷和鹽酸小檗堿均能通過活化的Stat3和Smad1/5/8的途徑促進hepcidin的表達，因此，我們只選取淫羊藿苷為下列動物實驗。與體外實驗結果相一致，淫羊藿苷能增強肝臟hepcidin表達，在誘導6h后Hepcidin mRNA表達水平與未對照組相比增加約50％(P＜0.05)，在淫羊藿苷作用后2d，與未處理的小鼠相比對hepcidin表達增加

24、約2.5倍（P＜0.05，淫羊藿苷對肝臟hepcidin表達的刺激作用從4天到16天開始減弱。由于肝臟hepcidin的改變，血清鐵也相應改變，血清鐵濃度在淫羊藿苷作用6h后與未處理的小鼠相比降低約40％(P＜0.05)，血清鐵濃度在淫羊藿苷作用后2天與未處理的小鼠相比繼續(xù)減少(P＜0.05)，血清鐵濃度淫羊藿苷作用后4d至8d仍低于未經處理的小鼠，而在16d時，處于未經處理的小鼠相類似的水平。淫羊藿苷對小鼠體內血清鐵的影響結果與肝臟h

25、epcidin表達的改變相一致，受肝臟hepcidin變化，脾鐵濃度也相應發(fā)生了變化，與對照組相比，總脾鐵從給藥后6h至16天不斷增加(P＜0.05)。相比之下，淫羊藿苷隊總肝鐵的影響并不明顯(P＞0.05)，這與相對恒定的肝鐵應對外來刺激的情況相一致。此外，淫羊藿苷的短期和長期給藥后小鼠沒有明顯的肝毒性表現(xiàn)。這個證據基于組織學檢查表明，淫羊藿苷在體內給藥的安全性。
　　結論:這些結果共同表明，淫羊藿苷對調節(jié)肝臟內hepcidin

26、濃度具有強大的調節(jié)作用，這種作用能帶來機體鐵水平的變化。
　　研究五;淫羊藿苷對Hamp1-/-小鼠體內鐵含量的影響。
　　目的:為了證實我們的發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷的功能通過加強肝臟hepcidin表達調節(jié)鐵的平衡。
　　方法:我們采用了一種新的hepcidin基因敲除小鼠模型，即Hamp1-/-小鼠。Hamp1-/-小鼠在體循環(huán)中不產生功能性的hepcidin，這些小鼠血清和器官存在嚴重的鐵過載。為了區(qū)分清楚血清鐵，我們給

27、予這些小鼠在低鐵飲食。在鐵耗盡情況下，我們能夠顯著降低Hamp1-/-小鼠體內血清鐵水平。我們將Hamp1-/-小鼠隨機分組，每組8只小鼠(n=8)。淫羊藿苷在Hamp1-/-小鼠腹腔注射的劑量為100mg/kg，對照組小鼠接受PBS與相應濃度的DMSO，Hamp1-/-小鼠在給藥后48h后處死。
　　結果:淫羊藿苷作用于Hamp1-/-小鼠血清鐵水平并沒有顯著改變，而在WT小鼠中淫羊藿苷在相同濃度和時間作用后血清鐵明顯降低，即1