體內(nèi)誘導(dǎo)胰島血紅素加氧酶-1適度表達(dá)對(duì)胰島移植物的保護(hù)作用.pdf

1、胰島移植治療糖尿病具血糖易控制、手術(shù)安全簡(jiǎn)單、可重復(fù)性佳、免疫抑制要求較低等優(yōu)點(diǎn)。然而，供體嚴(yán)重短缺限制了其在臨床上的應(yīng)用。異種移植具近無限的胰腺供給能力，是目前最有望突破這一“瓶頸”的途徑之一。但異種移植異種間的免疫排斥反應(yīng)問題，目前尚無有效的解決方案。 血紅素加氧酶(heme oxygenase ，HO)是血紅素分解代謝的起始酶和限速酶，可將血紅素分解為一氧化碳(CO)、亞鐵離子(Fe2＋）和膽綠素?，F(xiàn)有的研究證實(shí)，HO-1

2、 及其分解血紅素的產(chǎn)物組成的HO-1 系統(tǒng)可通過抗炎、抗氧化及抗凋亡作用在同種異體移植中保護(hù)移植胰島，另外，研究者還發(fā)現(xiàn)HO-1 尚可在動(dòng)物心、肝等異種移植模型中發(fā)揮保護(hù)移植器官的作用，而HO-1 是否可保護(hù)異種移植胰島、延長(zhǎng)其有功能存活期，目前尚不得而知，我們進(jìn)行了如下研究。 第一部分大鼠胰島分離改良研究 目的：探討SD 大鼠胰島分離、純化的較優(yōu)方案，并評(píng)價(jià)依該法分離所得胰島的生物性特性。方法：以濃度為0.75mg/m

3、l的Ⅺ型膠原酶經(jīng)膽管充分灌注SD 大鼠胰腺,完整分離后37℃水浴振蕩消化17min，Dextron70 不連續(xù)密度梯度（1.091、1.081及1.037）離心法分離、純化胰島，DTZ 染色鑒定胰島并計(jì)數(shù)得率，AO－PI 染色檢測(cè)胰島活性，糖刺激試驗(yàn)判定胰島功能,光鏡觀察體外培養(yǎng)胰島的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：純化后每只大鼠胰島收獲量為743.60±43.07，胰島純度>90％，胰島細(xì)胞活率>90％。胰島細(xì)胞在低糖和高糖刺激下分泌的胰島素濃度分

4、別為25.35±7.00和86.48±12.75 uIu.ml- 110islet- 1.45min- 1。結(jié)論：依改良后的分離純化方案分離大鼠胰島可獲得高純度高活率的胰島細(xì)胞，且細(xì)胞形態(tài)正常、功能良好。 第二部分鈷卟啉誘導(dǎo)胰島血紅素加氧酶-1 過表達(dá)研究 目的：探討鈷卟啉腹腔注射誘導(dǎo)大鼠胰島血紅素加氧酶-1（HO-1）過表達(dá)的量/效關(guān)系及其對(duì)胰島功能的影響。方法：大鼠分為5 組，A、B、C、D 等4 組分別在提取胰島前

5、24h 予腹腔注射2.5、5、7.5 及10mg/kg 體重的鈷卟啉溶液，對(duì)照組予1.5ml生理鹽水。改良Goth 法提取胰島，計(jì)數(shù)胰島得率、估定純度，real time-PCR和Western 印跡法檢測(cè)胰島組織內(nèi)HO-1mRNA 及蛋白表達(dá)，糖刺激試驗(yàn)評(píng)價(jià)胰島功能。結(jié)果：C、D 組大鼠在注射CoPP 溶液后出現(xiàn)機(jī)體損傷，D組部分大鼠死亡。A、B、C及對(duì)照組胰島得率及純度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），B組HO-1mRNA 及蛋白表

6、達(dá)量為4組中最高（B組HO-1mRNA 表達(dá)量達(dá)對(duì)照組的84.18 倍）。A、B 及對(duì)照組胰島于低糖刺激時(shí)，胰島素分泌量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而高糖刺激下，胰島素分泌量以B 組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A、B及對(duì)照組分別為:172.37±16.4、187.68±19.93 及91.25±12.64uIu. Ml-1.10islets-1.45min-1 ，P<0.05）。結(jié)論：腹腔注射5mg/kg 體重鈷卟啉相對(duì)安全，可大幅提

7、高大鼠胰島組織中HO-1的表達(dá)量，并能增強(qiáng)胰島功能。 第三部分血紅素加氧酶-1 過表達(dá)對(duì)異種移植胰島存活期的影響 目的：探討血紅素加氧酶-1（HO -1）在異種胰島移植中的移植物保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：采用大鼠對(duì)小鼠胰島移植模型，分為3 組，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及阻斷組供體提取胰島前24h腹腔分別注射生理鹽水、HO-1誘導(dǎo)劑鈷卟啉、CoPP及其阻斷劑鋅卟啉（ZnPP）。改良Goth法提取胰島。鏈脲佐菌素腹腔注射制作糖尿病小鼠模

8、型，腎包膜下胰島移植。比較各組受體移植后血糖維持正常時(shí)間，real time-PCR檢測(cè)各組移植物內(nèi)IL-10、TNF-a、IL-1b及INF mRNA 表達(dá)量，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA法）檢測(cè)各組受體小鼠血IL-10、TNF-a、IL-1b及INF含量。病理學(xué)檢查移植物淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果：3組中實(shí)驗(yàn)組供體胰島內(nèi)HO -1蛋白表達(dá)量最高,對(duì)照組及阻斷組皆較低。 實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖維持正常時(shí)間為16.33±1.51d，與對(duì)照組

9、的9.33±1.37d及阻斷組的9.67±1.03d 相比有顯著差異（P<0.05），而對(duì)照、阻斷兩組間無顯著差異（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組移植物內(nèi)IL-10mRNA表達(dá)量高于對(duì)照、阻斷兩組（P<0.05），對(duì)照、阻斷兩組間無顯著差異（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組受體血清IL-10含量亦高于對(duì)照、阻斷兩組（P<0.05），而對(duì)照、阻斷兩組間無顯著差異（P>0.05）。而3組移植物和受體血清TNF-a、IL-1b及INF表達(dá)、含量比較無顯著差異。