痢疾桿菌侵襲HeLa細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究.pdf

1、感染是微生物與宿主相互作用的結(jié)果。痢疾桿菌是重要的致病微生物，HeLa細(xì)胞是研究痢疾桿菌侵襲理想的細(xì)胞模型。為了揭示痢疾桿菌的致病機(jī)理和宿主細(xì)胞對痢疾桿菌侵襲的反應(yīng)，我們應(yīng)用cDNA微陣列技術(shù)對HeLa細(xì)胞與痢疾桿菌相互作用的過程中的基因表達(dá)譜變化情況進(jìn)行了研究。首先，采用侵襲試驗結(jié)合溫和的復(fù)紅美蘭染色法，通過對不同菌量痢疾桿菌在不同作用時間侵襲HeLa細(xì)胞的侵襲力和形態(tài)學(xué)研究，確定了痢疾桿菌侵襲HeLa細(xì)胞的最佳條件為：以108CFU

2、的痢疾桿菌侵襲106個HeLa細(xì)胞，作用3h時，痢疾桿菌2457T的侵襲力強(qiáng)，活菌數(shù)達(dá)到原侵襲量的50％左右。此時HeLa細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，為進(jìn)行侵襲后細(xì)胞表達(dá)譜研究的最佳時間點。 然后采用cDNA微陣列技術(shù)檢測了HeLa細(xì)胞被痢疾桿菌侵襲3h時的基因表達(dá)變化，共發(fā)現(xiàn)2倍以上差異表達(dá)基因836個，上調(diào)基因有517個，下調(diào)基因有319個。通過生物信息學(xué)分析，這些差異基因主要集中在DNA合成修復(fù)重組、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄、信號傳導(dǎo)傳遞、代謝相

3、關(guān)、蛋白翻譯合成、發(fā)育相關(guān)和分化等功能。初步推測了HeLa細(xì)胞對痢疾桿菌侵襲的應(yīng)答：HeLa細(xì)胞通過關(guān)閉某些信號通路(包括：PI3K和MKK4/MAPK信號通路)，激活某些信號通路(包括cAMP、Ca2+-CaM、PKC、Ras和P38/MAPK信號通路)，激活或抑制不同的信號分子，使細(xì)胞產(chǎn)生具有針對性的細(xì)胞效應(yīng)，包括誘導(dǎo)表達(dá)多種特異性蛋白(酶、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞因子等)、改變代謝途徑、減弱某些代謝、加強(qiáng)另一些代謝以及提高胞內(nèi)運輸能力等

4、，最終使自己可以適應(yīng)痢疾桿菌的侵襲而生存下去。 為了鑒定在病原菌與寄主細(xì)胞相互作用中新的未知的EST序列，采用代表約4000個新基因的cDNA微陣列研究了痢疾桿菌入侵前和入侵后3h的人上皮細(xì)胞差異表達(dá)的新基因，結(jié)果共鑒定到≥3倍或≤0.33的差異表達(dá)的代表新基因的EST序列76條，然后這些EST序列采用Siclone軟件分析，進(jìn)行電子延伸，在BLAST比較分析之后，其中25個延伸序列鑒定為與重要的腸道功能相關(guān)的已知基因，包括痢疾

5、桿菌-誘導(dǎo)的凋亡(TPPⅡ)、細(xì)胞骨架(如actin、talin、cofilin和gelsolin)、離子轉(zhuǎn)運(calpain-5、Nedd4和Calcium-transportingATPaseⅠ)、離子通道功能(如ABCA8、TPD52等)、粘膜屏障防御(CLECSF2)、異型生物質(zhì)代謝以及上皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制(vof-16)。更為重要性的是，通過RT-PCR克隆并測序，經(jīng)BLAST搜索，鑒定到3個顯著差異的新的EST序列，并用熒光實