ATM介導(dǎo)的Mad1與dCK磷酸化在細胞周期檢測點及DNA損傷修復(fù)中的功能.pdf

1、人類正常細胞時刻遭受各種內(nèi)源性（例如細胞內(nèi)正常代謝過程中的副產(chǎn)物氧自由基）及外源性（例如日光中波長為200-400納米的紫外線）基因毒性因子等作用導(dǎo)致DNA損傷。鑒于此，各種細胞周期監(jiān)測點的最重要的功能被認為是檢測DNA損傷;并且在能被修復(fù)的情況下誘導(dǎo)細胞周期停滯指導(dǎo)修復(fù)過程的完成。
　　共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥突變蛋白(ataxia-telangiectasia-mutated,ATM)名稱來源于失調(diào)性毛細血管擴張癥。它屬于磷脂

2、酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶(Phosphatidylinositol3-kinase-related kinases，PIKKs)超家族。在DNA損傷后被募集于損傷部位并被激活。激活后的ATM導(dǎo)致其下游為數(shù)眾多的參與DNA損傷修復(fù)或激活細胞周期檢測點的底物被快速磷酸化。多個獨立的大規(guī)模蛋白組學研究結(jié)果已發(fā)現(xiàn)規(guī)模龐大的DNA損傷反應(yīng)性磷酸化蛋白網(wǎng)絡(luò)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)了DNA損傷反應(yīng)性共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥突變蛋白(ataxia-telang

3、iectasia-mutated，ATM)與共濟失調(diào)毛細血管擴張癥和RAD3相關(guān)蛋白(Ataxia telangiectasia and Rad3-related protein,ATR)等超過700種蛋白的多達900個的磷酸化共同識別位點。其中包含有絲分裂停滯缺陷蛋白1(mitotic arrest-deficient protein1，Mad1)絲氨酸214位點及脫氧胞苷激酶(Deoxycytidine kinase，dCK)絲氨酸

4、74位點。這兩處磷酸化在我們的前期實驗中得到證實。因此本研究目的在于探討Mad1絲氨酸214位點及dCK絲氨酸74位點磷酸化參與DNA損傷修復(fù)中的機制。茲分述如下:
　　第一部分:
　　紡錘體組裝檢查點(The spindle assembly checkpoint，SAC)和DNA損傷修復(fù)檢查點是生物進化過程中兩個保守的機制。正因為有這些機制，盡管有各種DNA損傷，有絲分裂中染色體分離的高保真度依舊受到保護。這兩個機制一直

5、以來被認為是各自獨立發(fā)揮作用的。但是越來越多的證據(jù)顯示在此兩種機制中發(fā)揮作用的蛋白其功能是相互重疊的。先前我們的實驗已證實作為紡錘體組裝檢查點的關(guān)鍵組成蛋白-有絲分裂停滯缺陷蛋白1(mitotic arrest-deficient protein1，Mad1)同樣在DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮作用。我們發(fā)現(xiàn)敲除Mad1會導(dǎo)致細胞對電離輻射高度敏感，而且組蛋白伽馬H2AX在DNA損傷部位聚集灶持續(xù)時間延長（組蛋白H2AX在絲氨酸139磷酸化被

6、稱為伽馬H2AX，它是DNA雙鏈斷裂的敏感標志物，在DNA雙列斷裂位點灶狀聚集）。紡錘體組裝檢查點是真核細胞基因組穩(wěn)定性得以保持的關(guān)鍵自身監(jiān)控機制之一。在所有染色體被來自紡錘體兩級的紡錘體微管連接以前，紡錘體組裝檢查點(The spindle assembly checkpoint，SAC)會阻止細胞從有絲分裂中期進入后期。有絲分裂停滯缺陷蛋白1（mitotic arrest-deficient protein1，Mad1）作為SAC的

7、關(guān)鍵組分在有絲分裂中磷酸化。值得注意的是Mad1不論在有絲分裂及電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)(DDR)過程中均過磷酸化。在這兩個過程中Mad1磷酸化是依賴于ATM的。ATM本身在有絲分裂中被激活，并且在SAC中發(fā)揮作用。本研究通過體外試驗證實Mad1在絲氨酸214位點被ATM磷酸化。此位點磷酸化的Mad1促進其同源二聚體及其與有絲分裂停滯缺陷蛋白2(mitotic arrest-deficient protein2，Mad2)異源二聚體

8、的形成;進一步顯示ATM介導(dǎo)的絲氨酸214位點磷酸化對SAC的激活是至關(guān)重要的。綜上所述，表明ATM依賴性的Mad1磷酸化在SAC及DDR中具有雙重功能。
　　第二部分:
　　細胞周期監(jiān)測點是保證高保真真核細胞分裂的調(diào)控機制;在各個細胞周期時相監(jiān)測點均有相應(yīng)的許多蛋白參與。脫氧胞苷激酶(Deoxycytidine kinase，dCK)是內(nèi)源性DNA合成過程中脫氧核苷磷酸化及一些外源性抗癌、抗病毒核苷類似物磷酸化的關(guān)鍵限速酶

9、。dCK在DNA損傷后被激活，但其在DNA損傷修復(fù)中的作用機制在很大程度上尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，dCK在電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)中細胞周期G2/M檢測點發(fā)揮作用。我們發(fā)現(xiàn)ATM通過磷酸化dCK絲氨酸74位點激活其對DNA損傷的反應(yīng)。我們的研究進一步證實dCK絲氨酸74位點磷酸化是細胞周期G2/M檢測點的啟動分子事件。使用質(zhì)譜分析，進一步發(fā)現(xiàn)了dCK在DNA損傷修復(fù)中籍以發(fā)揮功能的復(fù)合物，包括Elongation facor1de

10、lta，CDC2(Cdk1)，prohibitin2，HSP90及Methylome subunit Plcln等，而其中與細胞周期進展最為相關(guān)的兩個蛋白是Cdk1和prohibitin2。細胞內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)電離輻射誘導(dǎo)dCK與細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase1，Cdk1)直接相互作用，并且抑制其功能，從而導(dǎo)致G2/M期阻滯。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了dCK新的功能。從另一個方面來看，本研究也發(fā)現(xiàn)了DN

11、A損傷修復(fù)中細胞周期G2/M檢測點新的調(diào)節(jié)機制。
　　總之，Mad1、dCK及Bub均為ATM磷酸化底物，不論受到DNA損傷抑或有絲分裂紡錘體損傷劑刺激的情況下。除了在DNA損傷修復(fù)中被人熟知的作用，本研究結(jié)果進一步證實了我們之前關(guān)于ATM在紡錘體裝配檢驗點中發(fā)揮重要功能的論述。闡明細胞周期檢查點的詳細作用機制，如Mad1在紡錘體裝配檢驗點及dCK在G2/M檢查點的機理，不僅使我們對最基本和經(jīng)典的生物過程有進一步了解，也具顯見的應(yīng)