原發(fā)系統(tǒng)型ALCL中ALK對預(yù)后影響機制的研究.pdf

1、研究背景與目的： 1985年Stein等首次描述間變性大細胞淋巴瘤(anaplasticlargecelllymphoma，ALCL)，并確認為一種新的淋巴瘤類型。ALCL是一種T細胞淋巴瘤，以CD30(腫瘤壞死因子受體超家族成員8，TNFRSF8)表達為特征，在成人非霍奇金淋巴瘤中比例小于5％，但在兒童中發(fā)病率較高，占兒童非霍奇金淋巴瘤的40％。原發(fā)系統(tǒng)型ALCL病理特征主要由淋巴樣細胞組成，細胞較大，胞質(zhì)豐富，胞核經(jīng)常成馬蹄

2、樣或胚胎樣。原發(fā)系統(tǒng)型ALCL包括兩個亞型：ALK(+)型和ALK(-)型。 本研究從ALCL病人臨床病情、診治過程、生存隨訪入手，首先驗證ALK(+)ALCL和ALK(-)ALCL對治療的不同反應(yīng)性及ALK對預(yù)后產(chǎn)生的影響，然后從可能與ALK有關(guān)的機體免疫、腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲、粘附、凋亡因子中尋找ALK對ALCL預(yù)后良好影響的可能機制與信號傳導(dǎo)途徑，并在細胞株中用不同方法抑制ALK的酪氨酸激酶活性表達后，實驗驗證這條信號傳導(dǎo)途徑對

3、預(yù)后相關(guān)因子的影響，為ALCL預(yù)后判斷及靶向治療提供理論與實驗依據(jù)。 方法： 1ALCL病人的病情與生存時間隨訪及ALK2與預(yù)后的關(guān)系本部分對34例ALCL進行了病情和生存狀況隨訪，其中4例病人失訪。隨訪資料主要包含以下字段：一般信息(病案號、病理號、姓名、年齡、性別)和臨床病情與生存狀況信息(發(fā)病部位、是否有骨髓侵犯、起病時是否有B癥狀、治療方案、治療結(jié)果、腫瘤臨床分期、IPI評分、生存時間、生存狀態(tài))。 采用

4、免疫組織化學(xué)染色和熒光原位雜交技術(shù)分別在蛋白水平和基因水平檢測ALCL組織中的ALK蛋白和染色體2p23區(qū)段斷裂。 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，生存率采用壽命表法，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法分析，Log-rank檢驗。各因子間相關(guān)分析采用卡方檢驗。 2ALCL臨床病理組織內(nèi)相關(guān)預(yù)后因子的篩選及與ALK相關(guān)預(yù)后信號傳導(dǎo)途徑推測采用免疫組織化學(xué)方法檢測并篩選ALK在ALCL組織內(nèi)影響的侵襲

5、，粘附，凋亡相關(guān)因子，運用免疫熒光檢測共定位的細胞內(nèi)蛋白，應(yīng)用PCR-SSCP分析P53的第5、6、7、8外顯子突變情況，運用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法分析，Log-rank檢驗，各因子間相關(guān)分析采用卡方檢驗，從中篩選與ALK和預(yù)后有關(guān)的因子，以期發(fā)現(xiàn)在ALCL組織內(nèi)ALK對預(yù)后產(chǎn)生影響的信號傳導(dǎo)途徑。 3ALCL細胞株內(nèi)抑制ALK酪氨酸激酶活性的研究及ALK相關(guān)預(yù)后信

6、號傳導(dǎo)途徑驗證在利用酪氨酸蛋白酶抑制劑除莠霉素A作用于ALCL細胞株karpas299以減弱ALK的酪氨酸激酶作用以及因AS干擾引起ALK表達降低這兩種造成ALK表達減弱的情況下，檢測組織中篩選出的信號傳導(dǎo)途徑分子。以臺盼藍拒染法和流式細胞檢測儀檢測藥物作用前后ALK的酪氨酸激酶活性變化以及細胞凋亡和細胞周期阻滯情況；對作用前后相應(yīng)信號傳導(dǎo)途徑蛋白進行免疫細胞化學(xué)染色分析(對半衰期較短的P53蛋白采取蛋白酶抑制劑處理延緩降解，并用PCR

7、-SSCP分析從基因水平分析有無突變)；對研究中關(guān)鍵性的ALK和cleavedcaspase3蛋白進行WesternBlotting半定量分析。 結(jié)果： 1ALCL病人ALK表達與臨床病情、生存時間隨訪的關(guān)系A(chǔ)LK(+)ALCL病人預(yù)后較ALK(-)ALCL預(yù)后好。臨床病情與生存分析發(fā)現(xiàn)與預(yù)后與ALK均相關(guān)臨床因子有：年齡、化療后完全緩解情況、臨床腫瘤分期和IPI。 2ALK與侵襲粘附及凋亡通路因子關(guān)系及其可能影

8、響預(yù)后的信號傳導(dǎo)途徑根據(jù)臨床分析結(jié)果，選擇有關(guān)因子在組織中進行了研究：CD44及其突變體、MMP2、TIMP1、nm23、CD56、survivin、Bax、bcl-2、P53、MDM2、HSP90a、細胞色素C和CleavedCaspase3。 經(jīng)過對上述因子的初篩，與ALK有關(guān)的因子有：HSP90a與ALK在細胞內(nèi)共表達，MDM2過表達、bax表達、細胞色素C表達、cleavedcaspase3的表達與ALK表達成正相關(guān)，P

9、53在ALK陽性的ALCL組織內(nèi)未見突變，bcl-2與ALK表達負相關(guān)，且上述因子均與預(yù)后有關(guān)，根據(jù)這些因子中存在的上下游調(diào)節(jié)關(guān)系或相互影響的關(guān)系，可能組成一條ALK影響ALCL預(yù)后的信號傳導(dǎo)途徑。 3ALCL細胞株karpas299除莠霉素A抑制ALK酪氨酸激酶活性與預(yù)后相關(guān)因子變化除莠霉素A作用karpas299細胞后，karpas299細胞酪氨酸激酶活性下降，細胞凋亡率上升，細胞周期在G1期阻滯，并隨藥物濃度梯度和時間作用

10、梯度的加大而升高；Hsp90a、MDM2表達減弱，野生型P53、bax、細胞色素C與cleavedcaspase3表達增強。表達變化與對照組相比差別明顯。 4karpas299細胞中ALK表達因AS干擾受抑制后對除莠霉素A的反應(yīng)與預(yù)后相關(guān)因子變化對因AS干擾引起ALK表達降低的karpas299細胞研究發(fā)現(xiàn)，ALK受其他因素影響而表達降低后，對除莠霉素A的反應(yīng)降低，除莠霉素A引起的凋亡較karpas299細胞明顯減弱。同樣的，M

11、DM2，P53，bax，細胞色素C，cleavedcaspase3等相關(guān)因子在藥物作用后的表達變化較未做干擾的karpas299細胞程度減輕。表達變化與對照組相比差別明顯。 結(jié)論： 1.ALK(+)ALCL病人預(yù)后優(yōu)于ALK(-)ALCL預(yù)后； 2.ALCL臨床預(yù)后相關(guān)因子主要有：發(fā)病年齡、完全緩解率、臨床腫瘤分期和IPI評分。ALK(+)ALCL病人發(fā)病年齡輕，臨床腫瘤分期較早和1PI評分較低，完全緩解率較高。

12、 3.ALCL臨床預(yù)后相關(guān)因子對應(yīng)組織因子表達為： ALK(+)ALCL：ALK、Hsp90a、MDM2過表達；Bax、細胞色素c、cleavedcaspase3有表達或強表達；bcl-2弱表達或無表達；無P53突變型蛋白表達。ALK(-)ALCL表達情況則與ALK(+)ALCL相反。 4.抑制ALK酪氨酸激酶活性后，ALK(+)ALCL細胞株中組織因子表達變化： ALK、Hsp90α、MDM2表達減弱；

13、P53野生型蛋白出現(xiàn)表達；Bax、細胞色素c、cleavedcaspase3表達增強。表達變化與對照組相比差別明顯。 根據(jù)臨床病理與生存分析，組織學(xué)研究和細胞學(xué)研究綜合分析表明，在ALK(+)ALCL中ALK通過這樣一條可能信號傳導(dǎo)途徑促進腫瘤發(fā)生：染色體易位造成ALK的過度表達，依附Hsp90保證其蛋白活性，發(fā)揮其酪氨酸激酶活性激活ras途徑，造成MDM2過表達，進而抑制了ALCL內(nèi)野生型p53的表達，但是由于野生型p53的微

14、量活性存在，其調(diào)節(jié)的下游分子仍然部分的發(fā)揮作用。因此通過抑制ALK進而抑制MDM2表達，可使野生型P53表達增強，其下游促凋亡分子Bax高表達，而抑制凋亡分子bcl-2表達減弱。Bax促進了細胞色素c從線粒體的釋放，最終引起凋亡執(zhí)行分子caspase3的激活，細胞趨向于發(fā)生凋亡。在這條途徑中P53僅為MDM2抑制，未突變或僅為一條等位基因突變，野生型P53蛋白在被增強表達后起到促進細胞凋亡的作用，因此使ALK(+)ALCL對化療有著良好