致倦庫蚊和騷擾庫蚊差異表達的氣味受體(OR)基因的功能研究.pdf

1、致倦庫蚊（Culex pipiens quinquefasciatus）廣泛分布于全球熱帶及亞熱帶地區(qū)，也是我國南方地區(qū)最常見的蚊種之一，它不僅是我國淋巴絲蟲病和流行性乙型腦炎的重要傳播媒介，也是西尼羅熱、西方馬腦炎等烈性蟲媒傳染病在我國的潛在傳播媒介。致倦庫蚊兼吸人、哺乳動物、鳥等多種宿主的血液，可使原本儲存于動物宿主中的病原體傳播至人群，所以，一直以來致倦庫蚊都被列為重點防治對象?；瘜W(xué)防治是目前致倦庫蚊最主要的防治方法，但蚊蟲抗藥性

2、的出現(xiàn)及抗藥性水平的不斷提高，導(dǎo)致防治效果越來越差，同時還對環(huán)境造成污染。因此，尋找一種對環(huán)境友好且安全有效的新型防治方法已迫在眉睫。
　　以往的研究發(fā)現(xiàn)，蚊蟲很多重要的行為都是依賴嗅覺系統(tǒng)完成的，并由遺傳基因所決定。蚊蟲的嗅覺系統(tǒng)包含多種嗅覺蛋白，氣味受體是其中比較重要的一種嗅覺蛋白，氣味受體識別氣味結(jié)合蛋白(OBPs)攜帶的氣味分子并激活嗅覺神經(jīng)元是嗅覺信號傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵步驟，也是蚊蟲完成搜尋定位宿主、吸血產(chǎn)卵等行為的分子基

3、礎(chǔ)。如果能夠明確氣味受體的功能，不僅對于闡明蚊蟲的嗅覺機理十分重要;同時，對于尋找防治蚊蟲的新靶標(biāo)，發(fā)展新的方法來干擾或阻斷蚊蟲尋找宿主吸血的過程，開辟新的蚊蟲治理途徑也具有重要的理論意義與應(yīng)用價值。
　　蚊蟲在長期進化過程中，遵循“適者生存”的原則，為了滿足自身生理行為的需求，已形成各具特色的氣味受體蛋白家族，對氣味物質(zhì)表現(xiàn)出不同的靈敏度和辨識度，同時，蚊蟲在不同生長階段，可調(diào)控ORs基因表達與否及表達量的高低，表現(xiàn)出對氣味物質(zhì)

4、不同的行為反應(yīng)。在基因組工程完成的基礎(chǔ)上，致倦庫蚊大量的ORs基因被分離識別，絕大部分ORs基因的功能還處于未知狀態(tài)，短時間內(nèi)不可能逐一進行研究，只能通過篩選縮小范圍，深入研究可能在致倦庫蚊雌蚊搜尋宿主完成吸血行為中起關(guān)鍵作用的ORs基因，為開發(fā)新型蚊蟲防治方法提供理論依據(jù)。
　　騷擾庫蚊(Culex pipiens molestus)與致倦庫蚊同屬尖音庫蚊復(fù)合組(Culexpipiens Complex)，擁有相似的基因組，形態(tài)

5、特征不容易區(qū)分，但生理行為方面存在明顯的差異，其中最為典型的是騷擾庫蚊屬自育性蚊蟲，雌蚊第一次產(chǎn)卵不需要吸血也可完成。實驗室株騷擾庫蚊即使第二個生殖周環(huán)也不吸血或很少吸血，與致倦庫蚊相比，ORs基因表達量一定存在差異。如果ORs基因在致倦庫蚊頭部高表達，而在騷擾庫蚊頭部低表達或不表達，那么這些ORs基因很可能參與完成致倦庫蚊雌蚊搜尋宿主、吸血等行為。
　　本研究希望從致倦庫蚊和騷擾庫蚊的吸血習(xí)性差異入手，從致倦庫蚊較多的氣味受體O

6、Rs中篩選出與雌蚊吸血行為相關(guān)的ORs基因。首先通過高通量測序和RT-PCR方法篩選兩亞種之間差異分布的ORs基因，并運用熒光定量PCR方法進一步比較差異分布的ORs基因在致倦庫蚊和騷擾庫蚊雌蚊頭部的起始表達量，借助RNA干擾技術(shù)驗證起始表達量差異較大ORs基因是否在致倦庫蚊雌蚊吸血行為中起關(guān)鍵作用。
　　結(jié)果如下:
　　(1)根據(jù)致倦庫蚊132個ORs基因序列，設(shè)計192對引物，利用RT-PCR方法擴增ORs基因，經(jīng)測序比

7、對發(fā)現(xiàn)成功擴增125個ORs基因，占總數(shù)的95％，未擴增ORs基因數(shù)7個。
　　(2)比較成功擴增的125個ORs基因在致倦庫蚊和騷擾庫蚊雌蚊不同組織部位及雄蚊中的分布，結(jié)果顯示101個ORs基因在致倦庫蚊和騷擾庫蚊雌蚊頭、胸、腹、足和雄蚊中均有分布，24個ORs基因在致倦庫蚊和騷擾庫蚊雌蚊頭、胸、腹、足和雄蚊中存在差異分布，其中13個ORs基因在致倦庫蚊和騷擾庫蚊雌蚊頭部差異分布。
　　(3)參考高通量測序結(jié)果，在致倦庫蚊

8、和騷擾庫蚊雌蚊中表達量差異較大的33個ORs基因。
　　(4)熒光定量PCR技術(shù)分析比較43個ORs基因（13個在致倦庫蚊和騷擾庫蚊雌蚊頭部差異分布的ORs基因和33個高通量測序篩選出的ORs基因，3個ORs基因重復(fù)）在致倦庫蚊和騷擾庫蚊雌蚊頭部的起始表達量，其中4個ORs基因（CquiOR25，CquiOR38，CquiOR41和CquiOR68）在致倦庫蚊和騷擾庫蚊雌蚊頭部表達量無顯著差異;39個在致倦庫蚊和騷擾庫蚊雌蚊頭部表

9、達量具有顯著差異的ORs基因中，26個ORs基因在致倦庫蚊雌蚊頭部的表達量顯著高于騷擾庫蚊，其中CquiOR5，CquiOR104，CquiOR117表達量差異倍數(shù)都大于500倍。
　　(5)通過RNA干擾技術(shù)，驗證CquiOR5，CquiOR104和CquiOR117基因是否在致倦庫蚊雌蚊完成吸血行為中起關(guān)鍵作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)基因CquiOR5被干擾后，雌蚊對宿主吸血反應(yīng)時間延長，對雌蚊吸血行為有抑制作用;靶標(biāo)基因CquiOR1