致倦庫蚊被武昌羅索線蟲感染后免疫基因差異表達(dá)及功能分析.pdf

1、蚊類是多種病原體和寄生蟲的傳播媒介，能引起瘧疾、登革熱和淋巴絲蟲病等嚴(yán)重傳染性疾病，屬于重要的公共衛(wèi)生害蟲。武昌羅索線蟲（Romanomermiswuchangensis）可感染并殺死十余種庫蚊及伊蚊幼蟲，是一種很有發(fā)展前景的生物滅蚊劑。其感染庫蚊后可引發(fā)宿主體內(nèi)包括模式識別受體（Pattern recognitionreceptors，PRRs）在內(nèi)的多種分子參與的一系列的免疫反應(yīng)。昆蟲通過PRRs識別和結(jié)合病原物的病原相關(guān)分子模式（

2、Pathogen-associated molecule patterns，PAMPs）來啟動先天性免疫反應(yīng)。C型凝集素（C-type lectins，CTLs）作為一種重要的模式識別受體，在病原的識別和清除方面發(fā)揮著多種功能并扮演著重要角色。本研究對致倦庫蚊（Culex quinquefasciatus）被武昌羅索線蟲感染后的存活率進(jìn)行了分析;并通過熒光定量的方法分析了致倦庫蚊被武昌羅索線蟲感染后不同時期模式識別受體基因CTL12(C

3、-type lectin12)、PGRPLC(Peptidoglycan recognition protein LC)、PGRPLE(Peptidoglycan recognition protein LE)、PGRPS1(Peptidoglycan recognitionprotein S1)、PGRPS6(Peptidoglycan recognition protein S6)，TOLL信號通路基因TOLL9A、CA CT（Ca

4、ctus），IMD(Immune deficiency)信號通路基因IMD(Immunedeficiency)、RELIA(Relish1A),JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer andactivator transcription)信號通路基因DOME（Domeless）、HOP(Hopscotch)、STAT1A(Signal transducer and activator of tra

5、nscription1A)，凝結(jié)黑化途徑基因SRPN6(Serine proteinase inhibitor6)、CLIPC2(Clip-domain serine protease C2)，免疫效應(yīng)分子基因PPO2(Prophenoloxidase2)、PPO5（Prophenoloxidase5）、CECA2（Cecropin2），自噬途徑基因ATG5（Autophagy-related protein5）、ATG8（Autoph

6、agy-related protein8)等19個免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況;篩選出顯著下調(diào)表達(dá)的免疫基因CTL12，并對其進(jìn)行了蛋白原核表達(dá)和體外功能實驗，初步探究了致倦庫蚊CqCTL12基因在其抵御細(xì)菌和線蟲感染的免疫反應(yīng)中的功能和作用。實驗結(jié)果如下:
　　1.致倦庫蚊被武昌羅索線蟲感染后的存活率分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6天后感染組孑孓的存活率極顯著低于對照組(p＜0.001)，表明武昌羅索線蟲對致倦庫蚊具有較高的致死率。
　　2.致

7、倦庫蚊被線蟲感染后不同時期免疫基因的表達(dá)水平分析。結(jié)果表明:CTL12和PGRPLC在線蟲寄生的初期（2天、4天）呈顯著性下調(diào)表達(dá)(p＜0.05)，推測其可能在庫蚊抵御線蟲入侵的過程中起著關(guān)鍵作用;而ATG5和ATG8在線蟲寄生的晚期（6天）呈顯著性上調(diào)表達(dá)(p＜0.05)，推測在線蟲寄生的后期庫蚊體內(nèi)可能出現(xiàn)了大量自噬現(xiàn)象。
　　3.CqCTL12和CqATG8基因的序列分析。結(jié)果顯示:CqCTL12基因包含486個核苷酸序列，

8、編碼162個氨基酸，蛋白分子量約為16.04kDa，含有典型的CRD結(jié)構(gòu)域，其CRD結(jié)構(gòu)域包括4個保守的半胱氨酸和1個Ca2+結(jié)合位點，在Ca+結(jié)合位點中含有一個可結(jié)合半乳糖的QLD基序和一個與Ca2+依賴活性相關(guān)的WND基序;CqATG8長為357bp，編碼118個氨基酸，蛋白分子量為14.056kDa。
　　4.原核表達(dá)純化獲得重組蛋白rCqCTL12和rCqATG8。rCqCTL12對細(xì)菌的凝集實驗表明: rCqCTL12能

9、顯著凝集革蘭氏陰性菌Escherichia coli和革蘭氏陽性菌Staphylococcus aureus，具有典型的Ca2+依賴效應(yīng)。
　　5.rCqCTL12與武昌羅索線蟲感染期幼蟲的體外結(jié)合。實驗表明:rCqCTL12能在體外與甲醛殺死的及活體狀態(tài)下的感染期幼線蟲結(jié)合，且這種結(jié)合與Ca+存在與否無關(guān)。
　　上述實驗結(jié)果表明，包括CqCTL12在內(nèi)的致倦庫蚊多種免疫基因在抵御線蟲和細(xì)菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用。研究結(jié)果