MnSOD基因轉(zhuǎn)染對擬老化大鼠內(nèi)耳的干預(yù)性保護(hù).pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分、病毒與非病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠耳蝸組織細(xì)胞的研究 目的:通過病毒與非病毒載體對胎鼠耳邊緣細(xì)胞和耳蝸組織轉(zhuǎn)染情況的研究，選擇出合適的內(nèi)耳基因治療載體。 方法:分別用質(zhì)粒（pEGFP-N1）、腺病毒（rAd5-EGFP）以及腺相關(guān)病毒（rAAV2-EGFP）載體轉(zhuǎn)導(dǎo)原代培養(yǎng)的新生Wistar 大鼠（≤72 小時）耳邊緣細(xì)胞或經(jīng)圓窗膜將病毒液注入鼓階外淋巴液，通過激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、C

2、CK-8、免疫組化（SP 法）、免疫組化（ApopTag 過氧化物酶凋亡檢測）、Westernblot 及ABR 檢測方法對三種載體加以比較。 結(jié)果:三種載體對原代培養(yǎng)的大鼠耳邊緣細(xì)胞的轉(zhuǎn)染研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒的轉(zhuǎn)染效率最高，而腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染對細(xì)胞活性影響最小。rAAV2和rAd5 對大鼠耳蝸組織的感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腺病毒和腺相關(guān)病毒攜帶的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白可在多種耳蝸組織中及轉(zhuǎn)染對側(cè)耳蝸組織表達(dá)，且并不引起明顯的耳蝸組織細(xì)胞凋亡。rA

3、AV2 攜帶的EGFP基因在第90天時仍可檢測到大量表達(dá)。rAd5 攜帶的EGFP基因在第30天時表達(dá)明顯減弱。 結(jié)論:病毒載體相對于非病毒載體以其高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、低細(xì)胞毒性在對原代培養(yǎng)的胎鼠耳邊緣細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。在病毒載體對大鼠耳蝸組織感染研究方面，腺病毒載體的優(yōu)勢在于其攜帶的基因表達(dá)迅速而高效，而腺相關(guān)病毒載體則以其長表達(dá)時程，低組織毒性見長。 第二部分、重組病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD的

4、構(gòu)建及其表達(dá) 目的:構(gòu)建含有大鼠源性錳超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase,MnSOD）基因的重組病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD，并檢測其在大鼠耳血管紋邊緣細(xì)胞和耳蝸組織內(nèi)的表達(dá)。 方法:將大鼠心肌組織來源的SOD基因克隆入融合表達(dá)載體pEGFP-N1 中,再以限制性酶切方法克隆入真核表達(dá)載體pSNAV2.0-IRES-EGFP 中，最后將其包裝為rAAV2-IRE

5、S-EGFP/MnSOD 病毒顆粒，用激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、PCR 及Westernblot檢測MnSOD基因的表達(dá)。 結(jié)果:真核表達(dá)載體pEGFP-N1/MnSOD和pSNAV2.0-IRES-EGFP/MnSOD 經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定均檢測到MnSOD基因的完整序列，被rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD 感染的耳邊緣細(xì)胞和內(nèi)耳組織中MnSOD蛋白的表達(dá)均高于空白對照耳。 結(jié)論:成功構(gòu)建了大鼠源性M

6、nSOD基因重組病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD,并使其在大鼠耳邊緣細(xì)胞和大鼠耳蝸組織中成功表達(dá)，為抗氧化基因治療內(nèi)耳疾病的研究奠定了基礎(chǔ)。 第三部分、MnSOD基因轉(zhuǎn)染對擬老化大鼠內(nèi)耳的干預(yù)性保護(hù) 目的:探討錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）基因內(nèi)耳注射對氨基糖甙類抗生素造成的擬老化大鼠內(nèi)耳損傷的干預(yù)性保護(hù)作用。 方法:在半乳糖注射的第6周

7、（注射氨基糖甙類抗生素之前2周）將rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD 病毒液經(jīng)圓窗膜注入擬老化大鼠的耳蝸外淋巴，通過免疫組化（ApopTag過氧化物酶凋亡檢測）、Westernblot 及MnSOD 活性檢測的方法觀察MnSOD基因在對抗內(nèi)耳氧化應(yīng)激損傷中的干預(yù)性保護(hù)作用。 結(jié)果:MnSOD基因的干預(yù)性注射，感染有效地減少了氧化應(yīng)激引起的擬老化大鼠內(nèi)耳細(xì)胞凋亡，有效地提升了內(nèi)耳中MnSOD的活性，并在一定程度上緩解了氨基