N-3不飽和脂肪酸誘導(dǎo)MDSC細(xì)胞分化并促腫瘤生長(zhǎng)的研究.pdf

1、目的:
　　N-3 PUFA（n-3 polyunsaturated fatty acids）為機(jī)體生命活動(dòng)必不可少的脂肪酸，目前臨床應(yīng)用于預(yù)防與改善心血管疾病。本研究擬深入研究N-3 PUFA對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，及其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。
　　方法:
　　(1) C57BL/6小鼠分為三組，分別為低脂飲食組（正常飲食）、高脂(n-6polyunsaturated fatty acids，n-6 PUFA)飲食組、

2、高魚(yú)油(n-3 PUFA)飲食組。在給予不同飲食4周之后，計(jì)數(shù)小鼠的脾臟細(xì)胞數(shù)，用流式細(xì)胞分析小鼠脾臟中的CD8+T、CD4+T、B和NK細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)、比例及活化CD8+T、CD4+T細(xì)胞的變化。用熒光示蹤染料CFSE標(biāo)記OT-1小鼠OVA257-264特異性CD8+T細(xì)胞，并將此細(xì)胞與OVA257-264肽荷載的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞過(guò)繼至不同飲食處理受體小鼠體內(nèi)，取不同組小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，分析CD8+T細(xì)胞在體內(nèi)的活化與增殖

3、。
　　(2) Q-PCR定量分析不同飲食組小鼠脾臟中的炎性相關(guān)細(xì)胞因子，流式細(xì)胞分析小鼠脾臟、外周血、肝臟中髓系來(lái)源的抑制性細(xì)胞(Myeloid-derivedSuppress cells，MDSCs)細(xì)胞群體的變化。
　　(3)瑞氏染色、鏡檢觀察高n-3 PUFA誘導(dǎo)的Gr-1+細(xì)胞形態(tài)。Q-PCR定量分析該細(xì)胞群體相關(guān)細(xì)胞因子的變化。將純化的該Gr-1+細(xì)胞與OT-1小鼠來(lái)源的OVA257-264特異性的CD8+T細(xì)胞

4、、OVA257-264荷載的DC共培養(yǎng)，體外觀察高n-3 PUFA誘導(dǎo)的Gr-1+細(xì)胞對(duì)CD8+T細(xì)胞增殖的抑制作用，并利用Transwell探討其免疫抑制機(jī)制。
　　(4)小鼠皮下接種B16-F10黑色素瘤細(xì)胞株，制備黑色素瘤模型，并觀察不同飲食處理后，黑色素瘤細(xì)胞在受者鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的情況。利用抗Gr-1選擇性抗體體內(nèi)阻斷MDSC，觀察MDSC細(xì)胞的清除對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)的影響。
　　(5)對(duì)正常和高魚(yú)油組小鼠進(jìn)行脾切手術(shù)，去除

5、小鼠的脾臟，觀察脾臟在高n-3 PUFA誘導(dǎo)MDSC細(xì)胞分化，及其在腫瘤生長(zhǎng)中的作用。
　　結(jié)果:
　　(1)不同組小鼠在給予飲食4周后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚(yú)油組小鼠的脾細(xì)胞數(shù)較其它兩組有顯著的上升，CD8+T、CD4+T、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的百分比則明顯下降。與此同時(shí)，魚(yú)油組中活化的CD4+T、CD8+T細(xì)胞的百分比也明顯下降。過(guò)繼CD8+細(xì)胞體內(nèi)增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，魚(yú)油組CD8+T細(xì)胞的增殖功能顯著下降。
　　(2) Q-PC

6、R結(jié)果顯示，魚(yú)油組小鼠脾臟中的IL-6、Chi313的表達(dá)較其他兩組上調(diào)。同時(shí)，流式結(jié)果顯示，魚(yú)油組小鼠脾臟、外周血、肝臟的MDSC細(xì)胞比例均較其他兩組有顯著上升。
　　(3)魚(yú)油組小鼠脾臟中純化的Gr-1+細(xì)胞在瑞士染色后，鏡下顯示出典型的髓系細(xì)胞形態(tài)，并呈明顯異質(zhì)性。該細(xì)胞高表達(dá)IL-6、TNF-α以及Arginase-1。細(xì)胞體外共培養(yǎng)結(jié)果顯示:魚(yú)油組脾臟來(lái)源的Gr-1+細(xì)胞較正常飲食組呈現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制OVA257-264特

7、異性CD8+T細(xì)胞增殖的能力。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示該抑制功能依賴細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸。
　　(4)魚(yú)油飲食組小鼠黑色素瘤的生長(zhǎng)速度較其他兩組均顯著增加。而MDSC的體內(nèi)選擇性阻斷將減緩該組小鼠體內(nèi)黑色素瘤的生長(zhǎng)速度。
　　(5)脾切對(duì)魚(yú)油飲食小鼠的黑色瘤生長(zhǎng)速度無(wú)明顯影響，同時(shí)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠脾切后，高魚(yú)油飲食小鼠肝臟中可代償性產(chǎn)生大量的MDSC。
　　結(jié)論:高n-3 PUFA的攝入可誘導(dǎo)大量MDSC的產(chǎn)生，并抑制