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文檔簡介
1、[目的]:生長抑制因子基因1(Inhibitorofgrowthgene1,ING1)定位于人類染色體13q33-34,是1996年發(fā)現的一個生長抑制基因。其主要生理功能為調節(jié)細胞周期,抑制細胞增殖,參與細胞衰老和凋亡調控,并在維持基因組穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。p33ING1b是其最主要的編碼蛋白。以往的研究證實多數惡性腫瘤細胞中NG1基因突變率很低;其mRNA轉錄豐度及p33ING1b蛋白表達水平目前各家研究結果不一,尚無定論,但較一致
2、的發(fā)現是膠質瘤細胞中有p33ING1b蛋白的亞細胞定位異常,即從正常情況下定位于胞核變?yōu)槎ㄎ挥诎麧{,這可能是導致膠質瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。一般情況下細胞漿向細胞核內的蛋白轉運通過Importinα/β蛋白轉運系統(tǒng)實現,Importinα作為適配器既與被運載蛋白的核定位信號肽(Nuclearlocalizationsignal;NLS)結合,又與Importinβ結合,形成三聯轉運復合物,并通過importinβ與核孔復合體(Nucle
3、ar-porecomplex;NPC)作用,啟動一系列入核轉運機制。然而,生理情況下p33ING1b蛋白的入核轉運機制怎樣?是什么原因導致了膠質瘤細胞中p33ING1b蛋白的亞細胞定位異常?均尚不清楚,有必要作深入系統(tǒng)的探討。 為此,本研究以p33ING1b蛋白核定位信號肽(p33ING1bNLS)的功能研究入手,采用一系列分子生物學實驗方法,初步探討了生理情況下p33ING1bNLS在p33ING1b入核轉運過程中的作用。旨在
4、為進一步深入探討p33ING1b蛋白正常入核機制及其在膠質瘤細胞中入核失敗的原因提供重要的線索及有用的研究工具。 [方法]:在本研究第一部分,我們首先應用逆轉錄PCR(ReversetranscriptPCR;RT-PCR)方法,從人胚肺纖維母細胞系MRC-5中擴增了p33ING1bNLS的互補DNA(ComplementaryDNA;cDNA)片斷,應用基因重組技術將這段c-DNA插入克隆載體Pbluescript-SK,經D
5、NA測序證實堿基序列無誤后,將該片段插入綠熒光蛋白(GFP)真核表達載體pEGFP-C1的多克隆位點,構建了GFP和p33ING1bNLS融合蛋白(GFP-NLS)的重組真核表達載體pEGFP-C1-NLS。然后用pEGFP-C1-NLS轉染MRC-5細胞,在其中表達GFP-NLS。通過綠熒光蛋白的示蹤作用,在熒光顯微鏡下觀察GFP-NLS的亞細胞定位,以便證實生理情況下p33ING1bNLS是否在該蛋白入核轉運過程中發(fā)揮重要作用。
6、 在本研究第二部分,首先以第一部分Pbluescript-SK中插入的p33ING1bNLScDNA片段為模板,通過PCR擴增適合插入原核表達載體pGEX-5X-3的p33ING1bNLScDNA片段,并將該片段插入pGEX-5X-3的多克隆位點,構建了p33ING1bNLS和谷胱甘肽-S-轉移酶(Glutathion-S-transferase;GST)融合蛋白(GST-NLS)的原核表達載體pGEX-5X-3-NLS。然后將該載
7、體轉化至大腸桿菌BL21中,通過IPTG誘導其在BL21中大量表達GST-NLS。應用超聲裂解菌體,將菌體裂解液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠混合,通過GST與谷胱甘肽的特異性結合使融合蛋白吸附沉淀,洗凈雜蛋白后應用洗脫液將純化的GST-NLS洗脫下來。 [結果]:第一部分:經酶切和DNA測序鑒定證實,我們已經通過RT-PCR成功的從MRC-5細胞系中擴增得到了p33ING1bNLS的cDNA片段,并將其插入了克隆載體Pbluescrip
8、t-SK中進行擴增,經鑒定該擴增片段的堿基序列完全正確。在將該擴增片段插入到真核表達載體pEGFP-C1后,經酶切和DNA測序證實,插入片段的全部堿基序列及其編碼框和終止子的堿基序列均完全正確。將該重組載體pEGFP-C1-NLS轉染到MRC-5細胞內后,GFP-NLS獲得有效表達,其綠熒光信號完全定位于細胞核。而空載體pEGFP-C1在MRC-5細胞中表達的綠熒光蛋白的熒光信號完全定位于細胞漿。 第二部分:經酶切和DNA測序鑒
9、定證實,我們已經通過PCR成功的從Pbluescript-SK中擴增得到了p33ING1bNLS的cDNA片段,并將其插入到pGEX-5X-3的多克隆位點,經鑒定證實所插入cDNA片段的全部堿基序列及其編碼框和和終止子的堿基序列均完全正確,插入片段全長183bp。編碼框分析pGEX-5X-3空載體表達的GST全長243個氨基酸,分子量約26.73kDa,pGEX-5X-3-NLS表達的GST-NLS全長287個氨基酸,分子量31.57k
10、Da。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示:經IPTG誘導,在大腸桿菌B21中成功的大量表達了GST-NLS和GST蛋白。經過谷胱甘肽瓊脂糖珠子親和沉淀純化,GST-NLS和GST蛋白被成功的純化出來。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳證實,被純化的GST-NLS和GST中無明顯雜蛋白條帶。 [結論]:以上結果說明在生理狀態(tài)下,p33ING1b完全定位于活細胞的核內,而且它的NLS在其入核轉運過程中起著決定性作用。此外,在該項研究中成功構
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