NMDA受體主亞基M3M4環(huán)自身免疫抗興奮毒性研究.pdf

1、該課題主要針對(duì)NR主亞基NR1的抗原性、免疫原性及其抗體對(duì)興奮性神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用進(jìn)行充分的研究論證,為興奮毒性腦損傷免疫干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下:一NR1激動(dòng)劑結(jié)合區(qū)域片段表位分析;采用生物信息學(xué)方法對(duì)人NMDAR主亞基NRla上兩個(gè)受體激活相關(guān)多肽片段P1(第一跨膜區(qū)前)、P2片段(第三、四跨膜域之間)的理化特性與抗原性進(jìn)行了分析.二M3M4環(huán)靶片段特異性單抗表位分析;為了進(jìn)一步獲得M3M4片段的表位信息,我們以單克隆抗

2、體MAB363(識(shí)別表位位于人NR1分子M3M4環(huán))淘篩噬菌體展示隨機(jī)12肽庫,對(duì)篩選克隆進(jìn)行特異性ELISA檢測和競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析.三M3M4片段免疫應(yīng)答檢測及抗血清的抗興奮毒性作用與機(jī)制探討;(一)M3M4片段免疫應(yīng)答檢測;(二)M3M4片段抗血清抗興奮毒性損害作用;(三)單克隆抗體MAB363抗興奮毒性損害作用;(四)單克隆抗體MAB363抗興奮毒作用機(jī)制探討.四抗M3M4單鏈抗體庫的構(gòu)建與篩選;單抗多為鼠源性,其Fc段是引起人體

3、排異反應(yīng)的主要部分,我們決定構(gòu)建鼠源抗NMDAR功能表位的單鏈抗體(scFv).利用全套噬菌體抗體表面展示技術(shù),從重組人NR1 M3M4環(huán)免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞中提取總RNA,并純化出mRNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用抗體可變區(qū)PCR混合引物進(jìn)行全套抗體重、輕鏈可變區(qū)(VH和VL)基因擴(kuò)增.綜上所述,我們利用生物信息學(xué)預(yù)測得出NR1主亞基P2片段上存在若干B表位,容易成為免疫干預(yù)的靶點(diǎn);以單抗MAB363篩選噬菌體隨機(jī)展示肽庫,結(jié)合表位肽競爭

4、性ELISA分析獲得其識(shí)別表位,且與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果吻合,提示該表位可能是NR1膜蛋白M3M4環(huán)靶片段上一個(gè)重要的B細(xì)胞主表位;進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明M3M4環(huán)重組肽具有免疫原性,陽性血清和單抗MAB363具有體外抗興奮毒作用,其機(jī)制可能與抑制鈣離子內(nèi)流、影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān);構(gòu)建抗M3M4重組肽的ScFv抗體庫,篩選并獲得抗M3M4和表位肽的陽性ScFv抗體.以上工作為免疫干預(yù)NMDAR治療興奮毒性神經(jīng)損傷打下了重要基礎(chǔ),相關(guān)