雞腺病毒血清11型和8b型的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、雞腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)是無囊膜、單節(jié)段的雙鏈DNA病毒，歸類于腺病毒科、禽腺病毒屬。雞腺病毒包括A-E5個(gè)種，包含12個(gè)血清型，分別為血清型1-8 a，8b-11。與FAdV感染相關(guān)的疾病主要有雞包涵體肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)、心包積水綜合征(Hydropericardium syndrome，HPS)和肌胃糜爛(Gizzard erosions，GE)等。FAdV在

2、雞群中廣泛存在，肉雞和蛋雞都可感染，以3-5周齡雞最為易感。雞腺病毒常與其它病原混合感染，致使雞群發(fā)病率和死亡率增高，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究從發(fā)病雞群中分離雞腺病毒，對(duì)病毒的分子特征、遺傳演化規(guī)律進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)分離株的致病性進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討我國(guó)流行毒株與當(dāng)前各國(guó)已經(jīng)報(bào)道的雞腺病毒的遺傳關(guān)系以及致病力的差異，說明我國(guó)雞腺病毒的流行特點(diǎn)，為雞腺病毒感染的防控提供理論基礎(chǔ)。
　　經(jīng)組織PCR檢測(cè)FAdV核酸陽(yáng)性的組織病料進(jìn)行研

3、磨過濾，經(jīng)卵黃囊途徑接種6.5日齡無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)的雞胚，并連續(xù)傳代3代進(jìn)行病毒分離。病毒分離物采用有限稀釋法在SPF雞胚上進(jìn)行純化，經(jīng)PCR檢測(cè)和序列測(cè)定鑒定，分離到兩株雞腺病毒分離株，分別命名為L(zhǎng)N/1507和HLJ/151129。對(duì)PCR擴(kuò)增的52k和hexon基因部分序列進(jìn)行同源性分析，分離株LN/1507與D種的血清11型FAdV在核酸序列上具有較高的同源性，且與我國(guó)近年報(bào)道

4、的血清11型FAdV HBQ12株的同源性最高，LN/1507分離株與HBQ12毒株的52k和hexon基因部分序列的同源性均為100％。分離株HLJ/151129的52k和hexon基因部分序列與E種的血清8b型FAdV在核酸序列上具有較高的同源性，其中52k基因部分序列的同源性為100％，hexon基因部分序列的同源性為99.6％。根據(jù)同源性和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，初步將LN/1507歸類為雞腺病毒D種、HLJ/151129歸類為雞腺病

5、毒E種。
　　為了解兩株分離株的分子特征，本研究通過高通量測(cè)序?qū)Ψ蛛x株LN/1507和HLJ/151129基因組全序列進(jìn)行解析，并與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表毒株進(jìn)行比對(duì)。LN/1507株基因組全長(zhǎng)44111 bp，共編碼36個(gè)ORF，GC％含量為53.58％，基因組末端有72-bp反向末端重復(fù)序列(ITR)，基因組內(nèi)部有一個(gè)重復(fù)區(qū)(TR-2)，與D種雞腺病毒基因組結(jié)構(gòu)相似。HLJ/151129株基因組全長(zhǎng)43534 bp，共編碼44個(gè)ORF，

6、GC％含量為57.76％，與已經(jīng)報(bào)道的E種FAdV的GC含量相近，其基因組結(jié)構(gòu)與E種雞腺病毒相似?；诨蚪M序列同源性比對(duì)，分離株LN/1507與FAdV-D種毒株同源性較高，同源性為90.2％-99.7％;而與FAdV-A和FAdV-C同源性最低，分別為56.3％和54.7％-55.3％;與FAdV-B和FAdV-E種毒株同源性為63.2％和72.1％-72.5％。遺傳演化分析表明，分離株LN/1507與FAdV-D種內(nèi)成員劃分為一簇

7、。為進(jìn)一步明確分離株LN/1507的血清型，對(duì)分離株LN/1507的hexon基因進(jìn)行遺傳演化分析，進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與基因組遺傳進(jìn)化分析一致，LN/1507與血清D種11型毒株劃分為同一分支。對(duì)分離株HLJ/151129的基因組序列進(jìn)行同源性比對(duì)，分離株HLJ/151129與FAdV-E種毒株同源性較高，同源性為93.1％-98.3％;與FAdV-A和FAdV-C種毒株同源性最低，同源性分別為57.4％和55.7％-56.2％;與FAd

8、V-B和FAdV-D種毒株同源性為64.1％和72.1％-72.8％?；诨蚪M序列的遺傳演化分析，HLJ/151129與FAdV-E成員劃分為同一個(gè)種。hexon基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析對(duì)該分離株血清型進(jìn)一步劃分，HLJ/151129與血清8b型毒株764株親緣關(guān)系最近。綜上，從病毒基因組結(jié)構(gòu)、GC％含量、同源性以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，將分離株LN/1507歸類為FAdV-D種的血清11型;分離株HLJ/151129歸類為FAdV-E種的血

9、清8b型。
　　用30日齡SPF雞對(duì)分離株LN/1507進(jìn)行致病性評(píng)價(jià)，病毒經(jīng)口服途徑和肌肉注射途徑感染，肌肉接種組感染雞只在感染后4d開始發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、縮頸、被毛蓬亂，至感染后8d臨床癥狀逐漸減輕，發(fā)病率為70％(7/10);口服感染組雞只感染后5d開始出現(xiàn)臨床癥狀，至感染后9d逐漸開始康復(fù)，發(fā)病率為60％(6/10);兩組死亡率均為0。肌肉注射組感染雞只在攻毒后7d開始出現(xiàn)抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)(8/10，80％)，至攻毒后42 d

10、抗體全部轉(zhuǎn)陽(yáng)(10/10，100％);口服感染組雞只在攻毒后7d開始出現(xiàn)抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)(4/10，40％)，至攻毒后150d仍有2只雞抗體沒有轉(zhuǎn)陽(yáng)(8/10，80％)。經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)，肌注組和口服組感染雞只在感染后7d均出現(xiàn)病毒血癥(10/10，100％)，兩組感染雞只口咽拭子和泄殖腔拭子均可檢測(cè)到排毒(10/10，100％)。對(duì)感染雞只病毒血癥和排毒持續(xù)期檢測(cè)，兩組感染雞只病毒血癥持續(xù)期達(dá)56 d以上，經(jīng)口咽拭子和泄殖腔拭子排毒達(dá)14

11、0 d以上。綜上，分離株LN/1507感染SPF雞后，可引起60％-70％發(fā)病率，死亡率為0。從臨床發(fā)病判定，D種FAdV、血清11型分離株LN/1507為低致病力毒株。
　　用30日齡SPF雞對(duì)分離株HLJ/151129進(jìn)行致病性評(píng)價(jià)，經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼途徑感染雞只。攻毒后雞只無明顯臨床癥狀，飲食和運(yùn)動(dòng)均正常。攻毒后7d開始出現(xiàn)抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)(3/10，30％)，攻毒后14 d出現(xiàn)抗體高峰(10/10，100％)，21 d抗體水平開始出現(xiàn)下降

12、。經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)，感染雞只在感染后3d開始經(jīng)口和泄殖腔排毒，排毒率均為100％(10/10)，排毒檢測(cè)持續(xù)到攻毒后28 d，仍有部分雞只排毒。感染雞只在攻毒后3d開始出現(xiàn)病毒血癥(9/10，90％)，感染后7d全部雞只出現(xiàn)病毒血癥，隨后病毒血癥開始下降，至攻毒后28 d，僅剩1只感染雞只存在輕度病毒血癥。SPF雞感染分離株HLJ/151129后，無明顯臨床癥狀，判定FAdV-E、血清8b型分離株HLJ/151129為無致病力毒株，