2008-2009年乙型腦炎病毒分離及其生物學特性分析.pdf

1、日本腦炎病毒（Japanese Encephalitis virus，JEV），又稱乙型腦炎病毒（簡稱乙腦病毒），是黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）的一員，主要引起人類或馬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染以及豬的流產(chǎn)，能通過持續(xù)感染的蚊子傳播給人，并且主要在脊椎動物宿主內(nèi)存在，特別是具有較高病毒血癥的豬和鳥類。在人類乙腦主要引起致死率較高的腦炎，致死率在20-50％之間，但是絕大多數(shù)的幸存者都留有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的后遺

2、癥，在家養(yǎng)動物如豬和馬，主要引起腦炎、流產(chǎn)甚至死亡。豬是主要中間宿主和擴散宿主，也是主要的傳染源。同時，近些年全球乙腦流行區(qū)域呈現(xiàn)擴大之勢，我國乙腦發(fā)病地區(qū)也有明顯擴展。WHO已將乙腦納入全球重點防控疾病。許多研究表明，豬流行性乙型腦炎與人流行性乙型腦炎密切相關，預防豬感染乙腦是防控人患乙腦的重要措施，因群中流行性乙型腦炎病原學調(diào)查和流行的乙腦病毒株分子生物學特性研究尤為重要，更為開發(fā)豬源的乙腦疫苗打下基礎。鑒于此病的流行和傳播特點，本

3、實驗首次嘗試了新的分離乙腦病毒的方法，全面的分析了當前在我國上述五個省市流行的乙腦病毒的流行特點和分子生物學特性.論文的主要研究內(nèi)容主要包括以下幾個方面：
　　 1病毒分離
　　 從江蘇、浙江、上海、山東和安徽5個省市不同的58家豬場采集蚊子、病豬血液和發(fā)病公豬精液，蚊子樣品存放輕便液氮灌保存和運輸，血液和精液冷藏運輸，送實驗室后立即處理采集病料，結合BHK-21細胞傳代和乳鼠腦內(nèi)接種盲傳病毒，細胞上盲傳4-5代后出現(xiàn)規(guī)

4、則細胞病變（CPE），小鼠腦內(nèi)接種引起神經(jīng)癥狀或表現(xiàn)為乙腦癥狀者保存毒種。結果從58份病料中分離出疑似病毒21株.
　　 2分離病毒的鑒定
　　 在鋪滿單層BHK-21細胞的96孔板上做間接免疫熒光，用羊抗兔的熒光抗體（IgG-FITC）染色，在熒光顯微鏡下觀察鑒定；參考GenBank中乙腦病毒基因序列，利用DNAstar（version5.0）軟件找出一段保守序列，應用Primer5.0軟件設計合成JEV M區(qū)基因的一

5、對特異性檢測引物，通過PT-PCR擴增條帶，測序鑒定；進而根據(jù)JEV（M-E）區(qū)基因設計一對特異性引物，通過RT-PCR擴增條帶，回收產(chǎn)物、連接PMD-18T載體并測序。結果從21份疑似病毒株中分離出15株乙腦病毒。
　　 3分離病毒株的生物學特性分析
　　 根據(jù)Woan-Ru Chen建立的方法進行基因分型分析。結果顯示本次實驗所分【離的15株乙腦病毒均屬于基因型Ⅲ型；新分離15株病毒E蛋白的氨基酸和核苷酸之間的同源性

6、較高，核苷酸同源性為99％-99.90％，氨基酸同源性為97.8％-100％。15株新分離毒株與乙腦病毒疫苗株P3株比較，氨基酸的同源性為96％-97％；與弱毒疫苗株SA14-14-2株比較，氨基酸的同源性為96.8％-98％。所有毒株在核苷酸序列上的差異均為堿基的替換，所有核苷酸或氨基酸均無插入或丟失。大多數(shù)核苷酸變異在氨基酸編碼的第三位，屬于沉默突變，不引起氨基酸改變。新分離病毒經(jīng)噬斑純化、鼠腦接種和連續(xù)5次細胞傳代后，病毒在BHK

7、-21細胞上的繁殖特性趨于穩(wěn)定，新分離15株乙腦病毒在感染BHK-21細胞后都能使細胞發(fā)生變圓、量度增加，拉網(wǎng)、脫落等特異性的細胞病變（CPE），產(chǎn)生病變時間穩(wěn)定在48小時左右；在BHK-21細胞上有相似的病毒滴度（106.1-106.8TCID50）；對9-11g小鼠腦內(nèi)接種30ul，104TCID50的新分離病毒，得到不同的致死率（60％-80％）。結果表明：在相同時間相同地理位置分離的乙腦病毒有非常高的同源性，但是隨著時間和地理位