宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47對(duì)PEDV復(fù)制的影響.pdf

1、一般來(lái)說(shuō)病毒感染后，宿主對(duì)病毒侵染最初的應(yīng)答是天然免疫應(yīng)答，如細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和抗病毒免疫分子分泌等，通過(guò)這些免疫機(jī)制，宿主可以拮抗病毒的入侵，或者為宿主建立獲得性免疫應(yīng)答贏得時(shí)間從而最終清除入侵的病毒。但是，很多病毒在長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中獲得了避免細(xì)胞過(guò)早凋亡和抑制炎癥反應(yīng)的能力，從而得以在宿主體內(nèi)大量增殖，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。
　　冠狀病毒(Coronavirus，CoVs)這一大類(lèi)病毒廣泛存在于自然界中，常見(jiàn)禽類(lèi)、哺乳動(dòng)物以及

2、人類(lèi)都易感。自2003年SARS-CoV(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)的流行到2012年的MERS-CoV（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV）的出現(xiàn)，引起了全世界人類(lèi)的恐慌，2010-2013年豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)在世界大范圍肆虐

3、更是重創(chuàng)了世界畜牧業(yè)，至此，人們才對(duì)冠狀病毒感染后致病的嚴(yán)重程度以及快速的傳播能力給予了足夠的重視。PED是由套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒亞科（Coronavirinae）α-冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）的豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，該病是豬的一種急性、高度接觸傳染性的腸道疾病，以嚴(yán)重的腸

4、炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水為主要特征，各種日齡的豬均易感，尤其是哺育仔豬，發(fā)病率有時(shí)高達(dá)100％，死亡率為30～80％。因此，開(kāi)展PEDV復(fù)制機(jī)制相關(guān)的基礎(chǔ)研究具有重要性，在解析冠狀病毒的復(fù)制機(jī)制方面更有普遍的借鑒意義。
　　本研究在對(duì)PEDVN蛋白核定位特性研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用免疫共沉淀和GST-pull down試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)PEDVN蛋白和NPM1蛋白存在相互作用，并通過(guò)激光共聚焦試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，N蛋白和NPM1蛋白共定位于細(xì)胞

5、的核仁中。隨后通過(guò)GST-pull down方法對(duì)兩者相互作用結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步鑒定，發(fā)現(xiàn)N蛋白aa147-294與NPM1蛋白的aa189-294是兩者相互作用的必需區(qū)域，并且NPM1蛋白的K263R突變可以促進(jìn)N和NPM1的相互作用。在探索NPM1蛋白在N蛋白核仁定位的作用中發(fā)現(xiàn)N蛋白的核仁定位并不依賴(lài)NPM1蛋白的核質(zhì)穿梭功能。在研究NPM1蛋白對(duì)病毒復(fù)制的作用中發(fā)現(xiàn)，在PEDV感染的細(xì)胞中NPM1蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NP

6、M1蛋白時(shí)，可促進(jìn)N蛋白的表達(dá)和PEDV的增殖;相反，利用靶向NPM1蛋白的特異性干擾小RNA分子沉默PEDV易感細(xì)胞內(nèi)源性NPM1蛋白的表達(dá)，N蛋白的表達(dá)和PEDV的增殖均受到抑制。進(jìn)一步對(duì)其分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)N蛋白和NPM1蛋白相互作用使其兔子被切割，上調(diào)細(xì)胞的抗凋亡能力，避免細(xì)胞過(guò)早凋亡，進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制。
　　病毒從感染宿主細(xì)胞開(kāi)始，宿主和病毒無(wú)時(shí)無(wú)刻不在相互作用。為了篩選與PEDV相互作用的宿主蛋白，本研究應(yīng)用酵母雙雜交

7、系統(tǒng)和GST-pull down技術(shù)分別發(fā)現(xiàn)PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47之間存在相互作用。隨后我們進(jìn)一步用免疫共沉淀，激光共聚焦試驗(yàn)證明了PEDVM蛋白和宿主蛋白EB3以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47之間確實(shí)存在相互作用。有趣的是，在研究NSP7和HSP47蛋白共定位時(shí)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)表達(dá)NSP7和HSP47蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)NSP7蛋白定位在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中，HSP47蛋白分布在宿主細(xì)胞的

8、細(xì)胞質(zhì)中，然而當(dāng)NSP7和HSP47蛋白共同表達(dá)時(shí)，兩者共定位在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核周邊，說(shuō)明兩者的相互作用改變了這兩種蛋白的亞細(xì)胞分布。本研究中另一項(xiàng)重要的內(nèi)容是PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用是否影響PEDV的復(fù)制，以及影響PEDV復(fù)制的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)PEDVM蛋白和宿主蛋白EB3以及菲結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用對(duì)PEDV復(fù)制的影響正好是對(duì)立的，在PEDV感染的細(xì)胞

9、中，EB3蛋白表達(dá)顯著增加，并且我們通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)有EB3蛋白真核表達(dá)重組質(zhì)粒來(lái)上調(diào)Vero E6中內(nèi)源性的EB3蛋白，通過(guò)檢測(cè)M蛋白的表達(dá)情況和TCID50測(cè)定，結(jié)果顯示可以促進(jìn)M蛋白的表達(dá)并且顯著增強(qiáng)PEDV的增殖。而病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用對(duì)病毒復(fù)制的影響正好相反，研究發(fā)現(xiàn)在PEDV感染48h和60h，HSP47蛋白表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)有HSP47蛋白真核表達(dá)重組質(zhì)粒來(lái)上調(diào)Vero E6中內(nèi)源性