BMP緩釋微球結(jié)合富血小板凝膠對(duì)hBMSCs增殖分化的影響.pdf

1、目的:
　　 1、細(xì)胞增殖分化過程的不同階段需要不同濃度和不同種類的生長因子協(xié)同參與。當(dāng)前骨組織工程局限于應(yīng)用單一種類或單一濃度生長因子以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，其結(jié)果并不令人十分滿意。富血小板凝膠中富含的生長因子具有促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的能力，骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力。
　　 2、目的就是設(shè)計(jì)一種骨組織工程材料，該材料能負(fù)載富血小板凝膠和骨形態(tài)發(fā)生蛋白，且能夠根據(jù)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生長過程中

2、對(duì)生長因子種類和濃度的不同需求進(jìn)行程序化釋放，進(jìn)而促進(jìn)其增殖和成骨分化。
　　 方法:
　　 1.取健康志愿者骨髓，全骨髓法分離純化培養(yǎng)出hBMSCs，并加以傳代擴(kuò)增。
　　 2.取健康志愿者血液，以Landerberg法制備富血小板血漿和乏血小板血漿。
　　 3.采用W1OW2復(fù)乳法制備負(fù)載BMP-2的PLAG微球。電鏡下觀察微球的形態(tài)、測量微球的粒徑大小;通過BCA法測定微球中BSA的含量來計(jì)算微球中

3、BMP-2的包封率;采用雙抗體夾心ABC-ELISA法來測定并描繪BMP-2體外釋放曲線。
　　 4.將實(shí)驗(yàn)分為六組，分別為A組:hBMSCs/PPG;B組:hBMSCs/PRG;C組:hBMSCs/BMP-2/PPG;D組:hBMSCs/BMP-2/PRG;E組:hBMSCs/BMP-MPs/PPG;F組:hBMSCs/BMP-MPs/PRG。將hBMSCs懸浮于PRP或PPP中，投入BMP-2或BMP-2微球或空白對(duì)照，然后

4、將各組hBMSCs的濃度調(diào)節(jié)一致，置于培養(yǎng)箱統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)。
　　 5.通過對(duì)各實(shí)驗(yàn)組中的DNA的變化的量來反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況;通過檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的ALP活性以及堿性磷酸酶mRNA、骨鈣蛋白mRNA、骨橋蛋白mRNA的表達(dá)情況，得出各試驗(yàn)組之間的結(jié)果并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)比分析。
　　 結(jié)果與結(jié)論:
　　 1、采用復(fù)乳法制備的BMP-2微球，微球表面光滑，平均粒徑約為9.86μm，包封率76％，30天總釋放為83％左

5、右的藥量。
　　 2、PRP和PPP經(jīng)激活劑激活后呈膠凍狀。電鏡下觀察呈現(xiàn)網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)，其孔隙率約為90％，孔徑大小約為50-100μm。
　　 3、單一添加PRP的實(shí)驗(yàn)組中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖量高于投放乏血小板凝膠的實(shí)驗(yàn)組;提示PRP釋放的生長因子能夠促進(jìn)hBMSCs的增殖。
　　 4、細(xì)胞培養(yǎng)早期，加入PRP的實(shí)驗(yàn)組中的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞ALP活性明顯高于未添加組，ALP mRNA與ALP活性表現(xiàn)一致;且骨鈣蛋白

6、mRNA、骨橋蛋白mRNA的表達(dá)量明顯高于只投放骨形態(tài)發(fā)生蛋白或者富血小板凝膠的試驗(yàn)組;提示PRP中富含的生長因子能與BMP-2協(xié)同促進(jìn)hBMSCs的增殖和早期成骨分化。
　　 5、同時(shí)添加骨形態(tài)發(fā)生蛋白及富血小板凝膠的試驗(yàn)組的ALP活性明顯高于其他四組，ALP mRNA與ALP活性表現(xiàn)一致;且骨鈣蛋白mRNA、骨橋蛋白mRNA的表達(dá)量明顯高于只投放骨形態(tài)發(fā)生蛋白或者富血小板凝膠的試驗(yàn)組。提示骨形態(tài)發(fā)生蛋白通過微球的降解緩慢釋放