低切應力對血管內皮屏障功能的調控及SL提取物的干預機制.pdf

1、研究背景及目的:
　　 隨著社會的發(fā)展，心血管類疾病已成為威脅人類生命健康和生活質量的頭號疾病。心血管疾病共同的病理基礎是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)。對動脈粥樣硬化發(fā)病機制的研究一直是醫(yī)藥學界研究的重點和熱點，到目前為止，對于As的發(fā)病機制尚未明確，但As發(fā)生的始動因素得到了國內外研究學者的普遍共識，即血管內皮損傷。血管內皮損傷直接導致內皮屏障功能障礙，血管內皮通透性增高，致病因子侵入內皮，誘導As發(fā)生

2、和發(fā)展。在導致血管內皮屏障功能障礙的因素中，血流切應力具有至關重要的作用。
　　 血流切應力已被證明在As斑塊發(fā)生的局灶性中具有重要作用。在低切應力(＜4 dyn· cm-2)血流作用下的動脈血管更易于形成斑塊，而高切應力(＞15dyn· cm-2)對血管具有保護的作用。血管內皮細胞直接感受血流切應力的變化，低切應力作用可以引起細胞骨架重構，導致血管內皮屏障功能的損害，使血液中的脂質等物質更易通過內皮細胞，促進As的形成。

3、>　　 F-actin(微絲肌動蛋白)是調節(jié)細胞骨架重構的主要收縮蛋白。F-actin重排依賴于肌球蛋白輕鏈(Myosin Light Chain，MLC)的磷酸化。肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin Light Chain Kinase,MLCK)和ROCK/ROK/Rho激酶(Rho Kinase,ROCK)是調節(jié)MLC磷酸化的兩種重要激酶。研究證實，血流切應力對成骨細胞的收縮具有Ca2+依賴性（MLCK通路）和非Ca2+依賴性（RO

4、CK通路）兩種途徑。那么血流切應力對臍動脈內皮細胞骨架重排的作用是否也具有Ca2+依賴性和非Ca2+依賴性還需要研究證實。參蓮提取物(SL extract)是在中醫(yī)臨床經驗的基礎上，結合現(xiàn)代醫(yī)學較為公認的As病理機制的“損傷—反應學說”和現(xiàn)代藥理學研究成果所精選出的防治As有效組方的提取物。本實驗室的前期研究結果證實，SL提取物能改善血管內皮功能，對As有很好的防治作用，但其改善內皮功能是否通過抑制內皮細胞骨架的改變或重組而起作用未見相

5、關報道。
　　 因此，本課題以研究參蓮提取物抑制細胞骨架重構為目的，從誘導細胞骨架重構的關鍵蛋白——肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化為切入點，重點研究SL提取物對介導MLC磷酸化的兩條關鍵通路:肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)通路和ROCK激酶信號通路的干預作用，從血流切應力角度分析SL提取物抑制細胞骨架重構的Ca2+依賴性和非Ca2+依賴性效應，探討SL提取物抑制As發(fā)生的作用機制。
　　 研究方法和內容:
　　 1

6、.SL提取物對低切應力介導的兔頸總動脈粥樣硬化形成的作用研究
　　 首先應用頸總動脈套管法建立局部低切應力兔動脈粥樣硬化模型。在模型建立的2周、4周和8周，運用電磁血流量計分別檢測套管近心端和對側的血流量，耳中動脈取血后，應用全自動生化儀檢測不同時間點各組動物的全血粘度和血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipopro

7、tein Cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HighDensity Lipoprotein Cholesterol，HDL-C)的水平;同時在2周、4周和8周時取血管近心端及對側相同體位血管，固定后HE染色觀察血管病理情況，掃描電鏡觀察內皮形態(tài)變化。
　　 2.SL提取物對低切應力誘導的兔頸總動脈粥樣硬化形成的機制研究
　　 在造模并給藥的2周、4周和8周，取頸總動脈套管處的近心端及對側相同體位的

8、血管，裂解組織后提取蛋白，應用Western blot檢測血管組織中肌球蛋白輕鏈(MLC)和MLC的磷酸化水平p-MLC，檢測肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和ROCK/ROK/Rho激酶(ROCK)的表達;免疫組織化學法檢測不同時間點MLCK蛋白和ROCK蛋白表達水平。
　　 3.SL提取物干預切應力介導的人臍動脈內皮細胞鈣內流的研究
　　 Bioflux1000控剪應力微流通道培養(yǎng)人臍動脈內皮細胞;數控剪切流系統(tǒng)加載不同

9、切應力后進行免疫熒光染色，應用激光共聚焦顯微鏡實時觀察細胞內游離鈣變化。在應用MLCK特異性阻斷劑ML-7，ROCK特異性阻斷劑Y-27632及鈣通道阻斷劑Nicardipine干預的前提下，加載不同切應力，觀察SL提取物對低切應力依賴的鈣內流的影響。
　　 4.SL提取物對切應力介導的細胞骨架重排的作用機制研究
　　 BioFlux1000高通量微流系統(tǒng)培養(yǎng)人臍動脈內皮細胞，加載切應力后，進行免疫熒光染色，應用激光共聚

10、焦顯微鏡觀察細胞骨架的變化，分析F-actin、MLCK、ROCK、MLC、p-MLC表達的變化。在應用MLCK特異性阻斷劑ML-7、ROCK特異性阻斷劑Y-27632、鈣通道阻斷劑Nicardipine干預后，觀察SL提取物對切應力介導的F-actin、MLCK、ROCK、MLC、p-MLC表達變化的影響，分析SL提取物的作用機制。
　　 研究結果:
　　 1.低切應力誘導的頸總動脈粥樣硬化兔模型復制成功:套管近心端形

11、成局部低切應力，對側為正常切應力。SL提取物對局部血流具有一定的改善作用，能劑量依賴性的增高血管近心端血流量，明顯改善血流切應力;SL提取物能降低As模型兔血脂水平，抑制內膜增厚和斑塊的形成;掃描電鏡觀察結果顯示SL提取物對低切應力誘導的血管內皮損傷具有抑制作用。
　　 2.SL提取物能時間依賴性的抑制MLCK和ROCK在近心端的表達，對MLC的磷酸化水平也具有明顯的抑制作用。MLCK在血管的分布變化隨時間的進展具有進行性增高的

12、趨勢，前期主要在內膜表達，4周和8周時在中膜和外膜表達較多;ROCK的表達分布主要集中在中膜。
　　 3.低切應力可以有效介導HUAEC細胞胞漿游離鈣的增高，其作用具有時間依賴性;HUAEC胞內游離鈣的增高作用主要與細胞外鈣的流入有關;SL提取物可以抑制低切應力誘導的細胞外鈣內流。
　　 4.低切應力誘導細胞骨架重構的作用與MLC磷酸化水平有關;在低切應力作用下，F(xiàn)-actin、MLCK、ROCK、p-MLC/MLC表達