二烯丙基二硫抑制人胃低分化腺癌增殖的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)可以抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在構(gòu)建 DADS處理胃癌MGC803細(xì)胞差異表達(dá)基因表達(dá)譜、差異轉(zhuǎn)錄因子活性譜、差異microRNA，研究DADS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。
　　方法：
　　通過人全基因組寡核苷酸微陣列芯片、轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片、microRNA芯片檢測 DADS作用于MGC803細(xì)胞后

2、差異基因的表達(dá)譜；Real-time PCR驗(yàn)證MMP9、TIMP3，Real-time PCR驗(yàn)證miR-222、miR-665。
　　結(jié)果：
　　1．系統(tǒng)構(gòu)建了DADS處理胃癌MGC803細(xì)胞差異基因表達(dá)譜，表達(dá)相差1.5倍以上為差異具有顯著性。與對照組相比，處理組上調(diào)基因1293個(gè)（>2.0基因384個(gè)），下調(diào)基因1228個(gè)（>2.0基因202個(gè)）。利用dchip軟件以t test，P<0.001水平篩選數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示

3、，處理組MGC803細(xì)胞和未處理組明確表達(dá)2521個(gè)基因，其中，292個(gè)在處理組中明確表達(dá)，而未處理組表達(dá)下調(diào)，116個(gè)在未處理組明確表達(dá)，而處理組表達(dá)下調(diào)。Hierarchical Clustering分析顯示，處理組和未處理組在全基因表達(dá)譜上存在明顯差異。差異表達(dá)基因能夠區(qū)分處理組和未處理組。通過Real-time PCR證實(shí)了MMP9和TIMP3基因在處理前后的表達(dá)情況，提示這兩個(gè)基因可能是DADS抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記。

4、r>　　2．差異表達(dá)基因的功能分類，通過多種生物信息學(xué)軟件對基因芯片數(shù)據(jù)基因綜合分析，系統(tǒng)評價(jià)了差異表達(dá)基因的功能分類。
　　Panther軟件分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因共參與152條pathway，61條pathway的實(shí)際參與基因數(shù)量超過預(yù)期基因值，而“Angiogenesis”、“Integrin signalling pathway”和“Oxidative stress response”3條pathway的P<0.05。下調(diào)基因共

5、參與41條pathway，其中41條pathway超過了預(yù)期基因數(shù)，但P>0.05。
　　上調(diào)基因共參與229個(gè)BP分類，106個(gè)BP分類中實(shí)際參與基因數(shù)超過預(yù)期基因數(shù)，“Signal transduction”、“Cell structure and motility”、“Cell proliferation and differentiation”、“Cell cycle control”等17個(gè)BP分類的P<0.05。下調(diào)基

6、因共參與109個(gè)BP分類，92個(gè)分類超過預(yù)期基因數(shù)，只有“Lactation，mamary development”分類的P<0.05。
　　上調(diào)基因共參與254個(gè) MF分類，99個(gè)分類超過預(yù)期基因數(shù)，“Actin binding cytoskeletal protein”、“Cytoskeletal protein”、“Signaling molecule”和“Extracellular matrix”4個(gè)分類的P<0.05。下

7、調(diào)基因共參與103個(gè)MF分類，其中95個(gè)分類超過預(yù)期基因數(shù)，但P>0.05。
　　DAVID軟件分析顯示Gene Ontology分類的BP分析，240個(gè)BP分類在胃癌MGC803細(xì)胞中上調(diào)基因參與，其中，細(xì)胞分化，抑制血管形成，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞通訊，免疫防御相關(guān)的“angiogenesis”、“positive regulation of cell differentiation”、“positive regulation of

8、transcription”、“negative regulation of cell communication”、“immunity and defense”等58個(gè)GO-BP分類的EASE score最低，均小于0.001，提示差異基因改變與這些細(xì)胞生物學(xué)行為的改變密切相關(guān)，其中上調(diào)IL-18、KLF6而調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫，與DADS抑制胃癌細(xì)胞增殖有關(guān)。98個(gè)下調(diào)基因參與的BP分類中，有27個(gè)EASE score小于0.05，這其中

9、包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)等過程。
　　232個(gè)在胃癌MGC803細(xì)胞中上調(diào)的基因參與了MF,4個(gè)EASE score小于0.001的GO-MF分類分別為“actin binding”、“cytoskeletal protein binding”、“growth factor activity”和“heparin binding”。90個(gè)下調(diào)基因參與的MF分類，有“cyclin-dependent protein kinase

10、activity”、“calcium-dependent phospholipase A2 activity”等8個(gè)EASE score小于0.05。
　　利用KEGG-PATHWAY和BIOCARTA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行pathway分析顯示，當(dāng)P<0.05時(shí)，上調(diào)差異基因參與1個(gè) BIOCARTA pathway（TSP-1 Induced Apoptosis in Microvascular Endothelial Cell）和4個(gè)

11、KEGGpathway（Wnt signaling pathway、Colorectal cancer、Regulation of actin cytoskeleton和ErbB signaling pathway）。18個(gè)下調(diào)基因參與BIOCARTA pathway，28個(gè)參與KEGG pathway，但沒有EASE score小于0.05的。
　　3．轉(zhuǎn)錄因子活性芯片檢測結(jié)果，以表達(dá)相差2.0倍以上為差異具有顯著性。結(jié)果表明，

12、與對照組相比，處理組轉(zhuǎn)錄因子有RB、GKLF/SP1、PUR、TFE3-L、beta M-globin factor B1、TFEB、NF-1/L、RVF、HiNF-A、NF-A3、Pax-6、Snail、SPERM1、TxREF，NF III等14個(gè)上調(diào)，GAS/ISRE、Pbx1、Stat5/Stat6、CdxA/NKX2、Freac-2、PPARα、CSBP、TGT3、c-myb binding protein、ETF、ISGF、

13、PREB、T3R、TFIID、CEF1、HFH-8、PPARγ、AP2、Fra-1/JUN、N-ras binding protein、PTF1-beta、Tat、TR、RREB、GATA1、Brn-3、IRF-1、PRE、Freac-7、C/EBP、Myc/Max、Smad SBE、Tax/CREB、HEN1、LCR-F1、TCF/LEF、NFIL-2、XBP1、X2BPC/EBPalpha、GATA-3、XBP-1、CD28RC,

14、NF-IL2B、LR1、ZNF174、E2、SRE、Angiotensinogen、ANG-IRE、XRE、LyF、PCF、SRF、Pax3、LyF-1、SSAP、oct-1、CP1、CTF、CBTF、TCE、ACF、HNF-4alpha2/1、MDBP、PO-B、Stat1/Stat3、Ets-1/PEA3、p53、MEF-3、PRDI-BFc、FAST-1、Pax-5等68個(gè)下調(diào)。通過靶基因預(yù)測與基因芯片取交集后發(fā)現(xiàn)22個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的

15、靶基因與基因芯片差異基因吻合。
　　4．綜合通路富集分析、差異基因分析、轉(zhuǎn)錄因子靶基因預(yù)測，得出 DADS可以抑制ERK/AP-1通路降低MMP9的表達(dá)；ERK/Ets-1抑制，降低MMP9的表達(dá)；通過影響 ERK/AP-1/Fra-1/uPA抑制 MGC803細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的活性。通過影響Frizzeld、DVL、APC、DKK基因表達(dá)，DADS可以影響wnt通路、轉(zhuǎn)錄因子tcf/lef、MMP，抑制MGC803細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

16、r>　　5．microRNA芯片檢測結(jié)果表明，與對照組相比，處理組 microRNA上調(diào)22個(gè)，下調(diào)20個(gè)。通過靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)24個(gè)microRNA的靶基因與基因芯片差異基因吻合。Real-time PCR驗(yàn)證了miR-222和miR-665，其靶基因TGFBR1、TIMP3、THBS1與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測其是DADS處理胃癌MGC803細(xì)胞作用的靶分子。
　　6．綜合PANTHER、DAVID軟件pathway分析發(fā)現(xiàn)，

17、上調(diào)基因主要富集于TSP-1 Induced Apoptosis in Microvascular Endothelial Cell、Wnt signaling pathway、Regulation of actin cytoskeleton、Angiogenesis、Integrin signalling pathway，與調(diào)控細(xì)胞骨架、腫瘤細(xì)胞血管形成有關(guān)。據(jù)此推測DADS處理胃癌細(xì)胞與細(xì)胞骨架調(diào)控、抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。綜合PAN

18、THER、DAVID軟件BP、MF分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)基因參與抑制血管形成、細(xì)胞通訊、肌動(dòng)蛋白粘附細(xì)胞骨架蛋白調(diào)控、細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)行為，推測DADS處理胃癌細(xì)胞與抑制其侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1．運(yùn)用高通量生物信息學(xué)分析技術(shù)，系統(tǒng)構(gòu)建了DADS處理胃癌MGC803細(xì)胞差異表達(dá)基因表達(dá)譜，P﹤0.001水平篩選到316個(gè)上調(diào)基因，136個(gè)下調(diào)基因。多種生物信息學(xué)軟件綜合分析，上調(diào)基因參與細(xì)胞分化，抑制血管形成，細(xì)胞凋

19、亡，細(xì)胞間通訊，免疫防御，特別是：TIMP3、APC2、THBS1、RND3，下調(diào)基因MMP9與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，KLF6、IL-18與腫瘤免疫有關(guān)。
　　2．運(yùn)用轉(zhuǎn)錄因子活性芯片構(gòu)建了DADS處理胃癌MGC803細(xì)胞差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子活性譜，其中14個(gè)上調(diào)，68個(gè)下調(diào)。生物信息學(xué)分析表明轉(zhuǎn)錄因子Gklf、PPARγ與DADS阻滯細(xì)胞周期、抑制侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　3．綜合通路富集、差異基因分析與轉(zhuǎn)錄因子靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)ERK/

20、AP-1/MMP9、ERK/Ets-1/MMP9、ERK/AP-1/Fra-1/uPA、Wnt（Frizzeld、DVL、APC、DKK、tcf/lef、MMP）、TGFβ通路與DADS抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　4．運(yùn)用microRNA芯片構(gòu)建了DADS處理胃癌MGC803細(xì)胞差異microRNA，共有22個(gè)上調(diào)，20個(gè)下調(diào)，證明miR-222、miR-665與DADS抑制胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　5．通過DADS處理胃