同型半胱氨酸通過人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA去甲基化加速內(nèi)皮衰老.pdf

1、端粒(telomere)是由DNA重復(fù)序列和結(jié)合蛋白組成的復(fù)合物結(jié)構(gòu),位于真核生物染色體末端。它對于細(xì)胞增殖過程中基因組的完整性以及染色體末端穩(wěn)定性發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),端粒DNA長度以及其結(jié)構(gòu)的維持與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。已有研究報(bào)道與年齡相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)的衰老和功能障礙在人類動脈粥樣硬化引起的疾病中發(fā)揮重要作用。高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemi

2、a,HHcy)是動脈粥樣硬化的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子。內(nèi)皮功能紊亂在同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)相關(guān)的動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和表觀遺傳學(xué)調(diào)控等參與了此過程。研究顯示,Hcy可加速內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞衰老,從而引起細(xì)胞功能障礙,然而,其作用機(jī)制尚不明確。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因可以

3、通過調(diào)控端粒酶的活性以維持端粒的長度和功能。因此,改變hTERT的表達(dá)可影響端粒的長度,進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和壽命。有研究報(bào)道,DNA去甲基化可使腫瘤細(xì)胞中的hTERT基因表達(dá)下降,端粒酶活性降低甚至失活和端粒長度縮短,提示hTERT基因的表觀遺傳學(xué)修飾在癌變過程中起重要作用。我們之前的研究在體內(nèi)體外發(fā)現(xiàn)Hcy通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控動脈粥樣硬化基因,從而引起內(nèi)皮功能紊亂,這促使我們考慮到Hcy是否通過通過表觀遺傳學(xué)修飾hTERT的表達(dá),進(jìn)而影

4、響人血管內(nèi)皮的衰老過程。本課題的目的在于探討Hcy對血管內(nèi)皮中hTERT表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制及其意義,以期進(jìn)一步揭示Hcy導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制,為臨床防治心血管疾病提供新的思路。
　　首先,我們將P2-P10代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分別放在正常內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Endothelial cell medium,ECM)和含病理生理濃度狀態(tài)下

5、Hcy(25μmol/L)的ECM中持續(xù)培養(yǎng),采用定量PCR法檢測細(xì)胞衰老標(biāo)志物P16和P21,以及代表端粒長度改變的端粒與單拷貝基因的比值(T/S比值)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常ECM培養(yǎng)的HUVECs中,P16和P21mRNA的表達(dá)水平在培養(yǎng)P8代開始明顯增加,端粒長度則在P10代開始縮短。然而,Hcy持續(xù)刺激的HUVECs的上述基因表達(dá)的增加和端粒長度的縮短,均較正常ECM培養(yǎng)時(shí)提前2代。我們應(yīng)用β-半乳糖苷酶染色檢測發(fā)現(xiàn)從P6代開始,Hcy

6、導(dǎo)致的細(xì)胞衰老比例增加。隨后,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和蛋白印跡法檢測hTERT的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)Hcy在mRNA和蛋白水平均下調(diào)hTERT的表達(dá)。而應(yīng)用可逆轉(zhuǎn)Hcy導(dǎo)致的DNA低甲基化的葉酸(100μmol/L)處理HUVECs后,可以在一定程度上抑制Hcy引起的P21的上調(diào),T/S和hTERT的下降,并降低了衰老細(xì)胞的比例,說明DNA甲基化可能參與了Hcy加快內(nèi)皮衰老的過程。為了進(jìn)一步研究hTERT表達(dá)下降的機(jī)制,我們采用亞硫酸鹽測序

7、技術(shù),檢測hTERT基因啟動子區(qū)甲基化水平,發(fā)現(xiàn)hTERT基因啟動子區(qū)CTCF(hTERT抑制性結(jié)合蛋白)結(jié)合位點(diǎn)存在DNA甲基化修飾,Hcy的處理可以使該位點(diǎn)發(fā)生去甲基化反應(yīng),降低該位點(diǎn)的甲基化程度,從而促進(jìn)CTCF結(jié)合到hTERT啟動子,并抑制其轉(zhuǎn)錄活性,降低hTERT的表達(dá)。
　　結(jié)論:我們的研究發(fā)現(xiàn),Hcy可通過DNA去甲基化機(jī)制增加hTERT抑制性作用蛋白CTCF結(jié)合到hTERT啟動子區(qū),下調(diào)hTERT的表達(dá),降低端粒酶