水稻米香基因的克隆.pdf

1、香米具有特殊的香味，深受消費(fèi)者的喜愛，因此香味成為稻米的一項(xiàng)重要的品質(zhì)指標(biāo)。在組成香味的100多種化合物中，2-乙?；?1-吡咯啉(2AP)已證實(shí)是引起香味性狀的關(guān)鍵性物質(zhì)。前人研究表明：位于水稻第8號染色體上，介于分子標(biāo)記RG1與RG28之間的一對隱性基因控制香味性狀。本研究利用該區(qū)域內(nèi)的一系列SSR標(biāo)記，不僅驗(yàn)證了前人的研究結(jié)果，同時也將基因進(jìn)一步定位在分子標(biāo)記RM8264與RM3459之間，物理距離約為800kb。通過比較水稻秈、

2、粳亞種之間的序列差異，在此區(qū)段內(nèi)發(fā)展了高密度的分子標(biāo)記。對定位群體中的2,891個個體進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)合性狀的檢測，最終將控制米香性狀的基因限定在分子標(biāo)記L04與L06范圍內(nèi)，對應(yīng)于秈稻序列上約62kb，而對應(yīng)于粳稻‘日本晴’序列上一個僅35kb的區(qū)段?；蝾A(yù)測結(jié)果顯示，秈稻和粳稻在此區(qū)域內(nèi)都包含有三個候選基因，分別編碼真核類碳酸酐酶(Cah)、3-甲基乙酰輔酶A羧化酶β鏈(Mccc2)以及甜菜堿脫氫酶(Badh2)。從‘南京11’(

3、秈稻、非香品種)的BAC庫中可分離得到覆蓋三個候選基因(包括完整的啟動子區(qū)域和3’非翻譯末端)的原始基因序列，分別構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化‘武香粳’(粳稻、米香品種)，作功能互補(bǔ)鑒定。結(jié)果表明轉(zhuǎn)Cah、Mccc2基因的植株香味性狀沒有發(fā)生變化，而只有Badh2轉(zhuǎn)基因后性狀得到了互補(bǔ)，表現(xiàn)非香特性。此外，通過篩選BAC庫，克隆和亞克隆香品種蘇御糯、非香品種‘南京11’的三個候選基因，分別進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Badh2基因序列上香與非香品種間存在著差

4、異，尤其是外顯子上8bp的缺失和3bp的突變將引起編碼框移碼，蛋白翻譯提前終止。以上證據(jù)均表示Badh2基因控制著米香性狀。RACE反應(yīng)獲得的全長cDNA結(jié)果顯示，在非香品種中Badh2基因編碼了一個393氨基酸的蛋白，與預(yù)測的氨基酸相比，缺少了N端110個氨基酸。而相應(yīng)的香品種中，badh2基因編碼的蛋白僅僅141氨基酸。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的同源模擬后可知，N端110氨基酸的缺失并沒有破壞NAD(核酸結(jié)合功能域)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但可能會引起一些相

5、應(yīng)的結(jié)構(gòu)變形，所以酶的底物結(jié)合特異性可能會有所改變。對于香品種所編碼的蛋白缺少C-端252氨基酸，缺少了催化結(jié)構(gòu)域，而二面體聚合結(jié)構(gòu)域也被破壞，所以理論上講其作為甜菜堿乙醛脫氫酶的功能已經(jīng)喪失。對香品種‘武香粳’和非香品種‘南京11’的不同組織器官的進(jìn)行實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測，除了根部位以外，Badh2基因在香和非香品種均有轉(zhuǎn)錄，尤其在幼嫩的水稻葉片中表達(dá)水平最高。由此推測，香稻中由于突變而引起的BADH2蛋白質(zhì)的失活導(dǎo)致2AP的