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文檔簡介
1、目的: EphBs 受體及ephrinBs 配體存在于成年的大腦、脊髓及外周組織中,在各種生理和病理過程中具有重要的作用。我們及其他實驗室的研究已經(jīng)證明脊髓水平ephrinBs/EphBs 信號參與傷害性信息調(diào)制及中樞敏感化,但其下游機制仍不清楚。本研究目的在于探討COX/PGE2/EP1 信號通路在脊髓水平ephrinBs/EphBs 激活引起的痛覺過敏中的作用。
方法:
1.觀察鞘內(nèi)注射ephrinB1-
2、Fc 對脊髓COX-1 和COX-2 表達(dá)的影響。①鞘內(nèi)注射ephrinB1-Fc(0.5μg,溶于5μl 生理鹽水中),在注射后30 分鐘,1,2,4,8,24 小時用Western blot 方法檢測COX-1,COX-2 的表達(dá),以探討ephrinB1-Fc 鞘內(nèi)注射后脊髓COX-1 和COX-2 表達(dá)的時間相。②鞘內(nèi)注射不同劑量ephrinB1-Fc(0.02,0.1,0.5 μg,溶于5μl 生理鹽水中),選擇各自表達(dá)的高峰點
3、,觀察注射后8 小時COX-1 的表達(dá)和注射后2 小時COX-2 的表達(dá),以探討ephrinB1-Fc 鞘內(nèi)注射后脊髓COX-1 和COX-2 表達(dá)的劑量依賴性。
2. 抑制COX-1,COX-2 或阻斷EP1 受體對鞘內(nèi)注射ephrinB1-Fc 引起的熱痛覺過敏的影響。在鞘內(nèi)注射ephrinB1-Fc(0.5 μg,溶于5μl 生理鹽水中)前30 分鐘,鞘內(nèi)給予非選擇性COX 抑制劑酮鉻酸,COX-1 抑制劑SC-56
4、0(2μg,溶于5μl 生理鹽水中)或COX-2 抑制劑SC-58125(2μg,溶于5μl 生理鹽水中)或EP1 受體阻斷劑SC-19220(2μg,溶于5μl 生理鹽水中), 觀察注射后30 分鐘,1,2,4, 8,24 小時熱輻射縮足潛伏期的改變。
3.抑制COX-1,COX--2 或阻斷EP1 受體對鞘內(nèi)注射ephrinB1-Fc 引起脊髓p-ERK和Fos 表達(dá)改變的影響。工具藥注射的劑量和時間點同2,采用Wes
5、tern blot 方法檢測ephrinB1-Fc 注射后30 分鐘p-ERK 的表達(dá),使用免疫熒光的方法檢測ephrinB1-Fc 注射后90 分鐘Fos 的表達(dá)。
結(jié)果:
1.鞘內(nèi)注射EphB 受體激動劑ephrinB1-Fc 后30 分鐘COX-1 蛋白的表達(dá)顯著減少,1 小時達(dá)最低點,注射后4 小時恢復(fù)到基線水平。在注射后8 小時的檢測時間點,COX-1 表達(dá)明顯增加并至少維持到注射后24 小時。CO
6、X-2 蛋白的表達(dá)在ephrinB1-Fc 注射后30 分鐘就開始增加,注射后2 小時達(dá)最高點,注射后4 小時恢復(fù)到基線水平。鞘內(nèi)給予不同劑量的ephrinB1-Fc (0.02, 0.1, 0.5μg 溶于5μl 生理鹽水中),在各自表達(dá)增加的高峰時間點,即COX-1 在注射后8 小時,COX-2 在注射后2 小時,均呈劑量依賴性增加脊髓COX-1 和COX-2 的表達(dá)。
2.鞘內(nèi)給予非選擇性COX 抑制劑酮鉻酸或COX
7、-1 抑制劑SC-560 或COX-2 抑制劑SC-58125 或EP1 受體阻斷劑SC-19220,均能抑制鞘內(nèi)注射ephrinB1-Fc 誘發(fā)的痛覺過敏。但在不同的時間點COX-1 抑制劑和COX-2 抑制劑效能有所不同。COX-2抑制劑在4 小時以內(nèi)有顯著作用,而COX-1 抑制劑在4 小時以后有顯著作用,非選擇性COX 抑制劑和EP1 受體阻斷劑在全程作用均有顯著作用。
3.鞘內(nèi)注射ephrinB1-Fc 明顯增加
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