ROS-ERK-PGE2信號通路調(diào)節(jié)皮膚損傷后早期炎癥反應.pdf

1、研究背景和目的:
　　創(chuàng)傷愈合是一個復雜的過程,包括炎癥反應、細胞增殖和組織重建三個互相重疊的階段。損傷自身作為一個信號啟動修復機制至愈合完成。傳統(tǒng)的觀念認為創(chuàng)傷后首先啟動的是止血過程,繼之炎癥細胞先后趨化至創(chuàng)面局部,參與創(chuàng)傷修復中的炎癥反應。但最近研究發(fā)現(xiàn)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)在調(diào)節(jié)創(chuàng)傷后早期炎癥反應中具有重要的作用,ROS依賴的氧化還原系統(tǒng)是啟動創(chuàng)傷修復級聯(lián)反應中必不可缺的環(huán)節(jié),ROS

2、可以作為第二信使參與調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導及調(diào)節(jié)基因表達等作用。
　　創(chuàng)傷后早期炎癥反應的主要炎癥介質(zhì)有5-羥色胺及前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)等,其中創(chuàng)傷局部的紅、腫、熱、痛主要與PGE2的產(chǎn)生相關(guān)。但創(chuàng)傷后PGE2快速升高的分子機制目前仍然不清。因此,本研究擬采用體外人皮膚角質(zhì)細胞機械損傷模型,觀察角質(zhì)細胞損傷后ROS的產(chǎn)生,探討ROS下游及上調(diào)PGE2上游的信號通路,試圖闡明ROS介導的信號途徑在創(chuàng)傷修復

3、中早期炎癥反應的作用機制。
　　第一部分、皮膚角質(zhì)細胞損傷后升高的ROS上調(diào)PGE2
　　目的:研究人皮膚角質(zhì)細胞機械損傷ROS生成增加對PGE2分泌的影響。
　　方法:
　　1、體外培養(yǎng)人皮膚角質(zhì)細胞至第3-8代,利用該細胞建立機械損傷模型;
　　2、將人皮膚角質(zhì)細胞分為三組:
　　a)單純損傷組(接受機械損傷組);
　　b)Nox抑制劑(DPI)預處理+損傷組;
　　c)無處理組(對照

4、組);
　　3、機械損傷后0、1、5、10、15、30、60min收集細胞樣本,熒光探針技術(shù)檢測各組細胞ROS的生成;
　　4、機械損傷后0、1、2、4、6、8、12、24h收集各組細胞上清液,EIA法檢測PGE2含量的變化。
　　結(jié)果:
　　1、在建模后不同時間點,損傷組人皮膚角質(zhì)細胞ROS生成明顯高于對照組,在損傷后1min開始有ROS生成,30min時點達到峰值(P<0.05)。
　　2、機械損傷后人

5、皮膚角質(zhì)細胞分泌PGE2量明顯升高,在損傷后6h抵達高峰(P<0.05);機械損傷后24h PGE2量仍明顯高于對照組(P<0.05)。
　　3、使用DPI抑制Nox活性可明顯減少機械損傷2h或4h后人皮膚角質(zhì)細胞內(nèi)PGE2的分泌量(P<0.05)。
　　結(jié)論:機械損傷可導致人皮膚角質(zhì)細胞分泌PGE2明顯增多,這與損傷后胞內(nèi)ROS含量的升高和Nox酶活性的升高密切相關(guān)。
　　第二部分、皮膚角質(zhì)細胞損傷后ROS通過活化E

6、RK信號上調(diào)PGE2
　　目的:探討皮膚角質(zhì)細胞損傷后ERK信號是否參與調(diào)節(jié)ROS介導的PGE2生成。
　　方法:
　　1、體外培養(yǎng)人皮膚角質(zhì)細胞至第3-8代,利用該細胞建立機械損傷模型;
　　2、將人皮膚角質(zhì)細胞分為四組:
　　a)單純損傷組(機械損傷組);
　　b)Nox抑制劑(DPI)預處理+損傷組;
　　c)ERK抑制劑(PD98059)預處理+損傷組;
　　d)無處理組(對照組)

7、;
　　3、機械損傷后0、0.25、0.5、1、2、4、6h收集樣本,western blot檢測各組細胞ERK、p-ERK的生成;
　　4、各濃度Nox抑制劑DPI預處理細胞后進行劃痕損傷,30min收集樣本,western blot檢測各組細胞p-ERK的生成;
　　5、使用PD98059抑制ERK活性后進行劃痕損傷,2h、4h收集各組細胞上清液,EIA法檢測PGE2含量的變化。
　　結(jié)果:
　　1、機

8、械損傷后ERK磷酸化明顯增多,在15min時磷酸化最為明顯(p<0.05),且在1h后恢復到正常水平。
　　2、各濃度DPI預處理組人皮膚角質(zhì)細胞p-ERK表達均低于單純損傷組,其中DPI為10umol/L時,p-ERK顯著下降(p<0.05)。DPI為1umol/l及5umol/l時,其p-ERK表達高于對照組(p<0.05)。
　　3、PD98059預處理皮膚角質(zhì)細胞,于損傷后2h、4h收集細胞上清液,損傷組上清中PGE

9、2的質(zhì)量濃度較對照組顯著升高(p<0.05),PD98059預處理組產(chǎn)生PGE2均較損傷組顯著降低(p<0.05)。
　　結(jié)論:皮膚角質(zhì)細胞損傷后ERK信號被活化,激活的ERK信號參與調(diào)節(jié) ROS上調(diào)PGE2。
　　第三部分、ROS/ERK通過COX-2上調(diào)PGE2參與損傷后早期炎癥反應
　　目的:探討參與皮膚角質(zhì)細胞損傷后炎癥反應的信號通路及分子機制。
　　方法:
　　1、體外培養(yǎng)人皮膚角質(zhì)細胞至第3-8

10、代,利用該細胞建立機械損傷模型;
　　2、將人皮膚角質(zhì)細胞分為五組:
　　a)單純損傷組(機械損傷組);
　　b)Nox抑制劑(DPI)預處理+損傷組;
　　c)ERK抑制劑(PD98059)預處理+損傷組;
　　d)COX-2抑制劑(NS398)預處理+損傷組;
　　e)無處理組(對照組);
　　3、機械損傷后0、1、2、4、6、8h收集樣本,western blot檢測各組細胞COX-2的生

11、成;
　　4、各濃度DPI、PD98059預處理細胞后進行劃痕損傷,2h收集樣本,western blot檢測各組細胞COX-2的生成;
　　5、使用NS398抑制COX-2活性后進行劃痕損傷,2h、4h收集各組細胞上清液,EIA法檢測PGE2含量的變化。
　　結(jié)果:
　　1、機械損傷后COX-2蛋白表達水平呈逐漸增多的趨勢,至2h COX-2表達水平升至最高(p<0.05),且觀察到在損傷后24h其含量仍比未損

12、傷時升高。
　　2、各濃度DPI+損傷組人皮膚角質(zhì)細胞COX-2的含量均低于損傷組(p<0.05),其中DPI為10umol/L時,COX-2含量顯著被移植下降(p<0.05)。
　　3、各濃度PD98059預處理組中人皮膚角質(zhì)細胞COX-2的含量均低于損傷組(p<0.05),其中PD98059為30umol/L時,COX-2含量顯著下降(p<0.05)。
　　4、NS398預處理皮膚角質(zhì)細胞,于損傷后2h、4h收集細