肝再生增強(qiáng)因子對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)急性腎衰大鼠腎小管上皮細(xì)胞保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察肝再生增強(qiáng)因子(augumenterofliverregeneration，ALR)對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)的急性腎衰大鼠腎功能以及小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步闡明ALR影響小管上皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為尋求新的治療手段奠定基礎(chǔ)。 方法：實(shí)驗(yàn)分為：A組為正常對(duì)照組，給予生理鹽水100~tg／kg；B組為模型組，給予慶大霉素140mg／kg和生理鹽水100[tg／kg；C組為模型+空質(zhì)粒干預(yù)組：慶大霉素140mg／kg和空質(zhì)粒

2、表達(dá)上清100gg／kg；D組為模型+ALR干預(yù)組：根據(jù)給予的ALR不同劑量分為D1和D2兩個(gè)亞組。D1組：慶大霉素140mg／kg加rrALR80~g／kg；D2組：慶大霉素140mg／kg加rrALRl60[tg／kg。采用常規(guī)生化方法檢測(cè)各組大鼠血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)和尿NAG的差異；PAS染色觀察各組大鼠腎組織病理學(xué)改變。采用免疫組化法檢測(cè)各組。腎組織中ALR、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)和分布的差異，Wes

3、ternBlot法檢測(cè)各組腎組織中ALR、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)量的差異。采用電鏡、DAN瓊脂糖凝膠電泳和TUNNEL法檢測(cè)各組間腎小管上皮細(xì)胞凋亡的情況。 結(jié)果：1．B組、C組、D1和D2組與A組相比，第4天、8天、12天、16天大鼠BUN、Scr和尿NAG水平顯著增高(P<0．05)；B組與C組相比，各時(shí)間點(diǎn)大鼠BUN、Scr和尿NAG水平無(wú)明顯改變(P>0．05)；D1組與C組比較，第4天、8天大鼠BUN、Scr和尿N

4、AG水平顯著降低(P<0．05)，第12天、16天、21天大鼠BUN、Scr和尿NAG水平輕度下降，無(wú)顯著性差異(P＞O．05)；D2組與B組、C組比較，第4天、8天、12天、16天大鼠BUN、Scr和尿NAG水平明顯降低(P<0．05)，第21天大鼠D2組BUN、Scr和尿NAG水平較B、C組輕度下降，無(wú)顯著性差異(P>0．05)；D2組BUN、Scr和尿NAG水平較Dl組輕度下降，但無(wú)顯著性差異(P>0．05)。 2．PAS

5、染色顯示，光鏡下A組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常；B組和C組大鼠小管上皮細(xì)胞嚴(yán)重變性、崩解和脫落，腎小管管腔擴(kuò)張，可見(jiàn)大量管型，腎間質(zhì)水腫，伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；D1和D2組大鼠腎組織損傷病理學(xué)改變均較B、C組有不同程度的減輕，腎小管上皮細(xì)胞再生現(xiàn)象明顯，上皮細(xì)胞的胞核較大，染色質(zhì)增多增粗，細(xì)胞質(zhì)較少，細(xì)胞扁平，管腔擴(kuò)張，細(xì)胞排列紊亂，管型減少，間質(zhì)輕度水腫，僅少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。 3．ALR蛋白在A組正常大鼠髓質(zhì)的髓襻、遠(yuǎn)曲小管和集合管的小

6、管上皮細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性，呈棕黃色，皮質(zhì)區(qū)表達(dá)陰性；B組、C組、D1和D2組與A組相比，ALR蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0．05)，在皮質(zhì)區(qū)的近端小管上皮細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)；B組與C組相比，各時(shí)間點(diǎn)大鼠ALR蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞O．05)；Dl、D2組與B、C組相比，第4天、8天、12天大鼠ALR蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0．05)，第16天大鼠ALR蛋白的表達(dá)在上述各組間無(wú)明顯差異；D1和D2組相比，各天數(shù)大鼠ALR蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異(P~0．

7、05)。 4．光鏡下A組正常大鼠腎組織僅見(jiàn)少量的腎小管上皮細(xì)胞核中有棕黃色顆粒的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞；B組大鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)了一定程度的細(xì)胞增生，主要分布于皮髓質(zhì)的小管上皮細(xì)胞，未累及腎小球細(xì)胞；B、C組間H(proliferationindex)值無(wú)顯著差異(P>0．05)，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞呈散在分布；D組PI值較B組和C組顯著增高(P<0．05)，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞呈彌漫性分布，皮質(zhì)區(qū)、皮髓交界區(qū)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞明顯較B、C大

8、鼠活躍；D1與D2間PI值無(wú)明顯差異(P>0．05)。 5．采用透射電鏡法，在慶大霉素誘導(dǎo)的急性腎衰大鼠各組動(dòng)物模型中均可檢測(cè)到腎小管細(xì)胞凋亡的存在。DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示，A組未見(jiàn)到典型的梯形條帶，DNA呈一條大分子片段，緊靠加樣孔，C組大鼠腎組織DNA瓊脂糖凝膠電泳則呈現(xiàn)出特征性梯形條帶，表現(xiàn)為180bp-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段；D1和D2組大鼠腎組織DNA瓊脂糖凝膠電泳片段化較C組明顯減輕。TUNNEL染色顯示，

9、A組大鼠腎組織切片中偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞；B組、C組、D1和D2組與A組相比，凋亡細(xì)胞明顯增多，凋亡細(xì)胞多數(shù)是遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞，少數(shù)為近端小管上皮細(xì)胞，腎小球未見(jiàn)凋亡細(xì)胞。D1和D2組與C組相比，凋亡指數(shù)明顯降低(P<0．05)；D1和D2組間凋亡指數(shù)無(wú)明顯差異(P>0．05)。 6．Bax和Bcl-2蛋白在A組大鼠腎組織小管上皮細(xì)胞幾乎不表達(dá)，與A組相比，第4天、8天、12天的B組、C組、Dl和D2組大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)顯

10、著增強(qiáng)(P<0．05)，第16天大鼠上述各組間Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)差異(P>0．05)，Bax和Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞主要見(jiàn)于近曲小管、遠(yuǎn)曲小管和集合管；B組與C組間Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)差異(P>0．05)；D1和D2組與C組相比，Bax蛋白顯著增強(qiáng)(P<0．05)，Bcl-2蛋白顯著降低(P<0．05)；Dl組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)較D2組無(wú)顯著差異(P>0．05)。 結(jié)論：我們通過(guò)本課題的研究，探討rrALR

11、在中毒性急性腎衰竭時(shí)對(duì)腎功能恢復(fù)及小管上皮細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用，并進(jìn)一步闡明ALR影響小管上皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，并得出以下結(jié)論： 1．rrALR明顯降低急性腎衰大鼠血尿素氮、肌酐和尿NAG水平，減輕腎組織病理學(xué)改變，同時(shí)ALR在損傷腎組織局部表達(dá)增加，提示rrALR能防止腎小管細(xì)胞壞死，保護(hù)腎功能； 2．rrALR明顯增加腎小管上皮細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)，提示rrALR對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的再生修復(fù)具有促進(jìn)作用； 3