丹參素和丹酚酸B對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂分化Sirt1-PPARγ途徑的影響及其抗骨質(zhì)疏松機(jī)制探討.pdf

1、目的： 課題組曾證明丹參水溶性提取物能有效防治糖皮質(zhì)激素引起的大鼠骨質(zhì)疏松，對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的體外骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(marrow stromal cell,MSCs)的成脂分化有抑制作用，但對(duì)成脂分化的作用機(jī)制并不明確。丹參素和丹酚酸B是丹參水溶性提取物的有效成分，本研究通過觀察丹參素和丹酚酸B對(duì)體外大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響，以探討丹參素和丹酚酸B對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的調(diào)節(jié)作用；通過觀察丹參素和丹酚酸B對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

2、成脂分化的過程中組蛋白去乙?；?nuclear protein deacetylase Sirtl)、過氧化物酶增殖體激活受體(PPARr)的影響，探討丹參素和丹酚酸B對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的作用機(jī)制，從而探討中藥丹參在防治骨質(zhì)疏松上的作用機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)中藥作用新靶標(biāo)提供科學(xué)依據(jù)。 方法： 1.大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及脂肪分化的鑒定： 通過密度梯度離心法和傳代貼壁篩選法相結(jié)合，分離純化大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。應(yīng)

3、用油紅染色法、油紅染色化學(xué)比色法、堿性磷酸酶法和茜素紅染色法判斷是否成功誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，間接鑒定骨髓基質(zhì)細(xì)胞。 2.丹參素和丹酚酸B對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞與成骨細(xì)胞分化的影響： 觀察不同濃度丹參素和丹酚酸B對(duì)成脂分化率、脂蛋白脂酶mRNA的表達(dá)和堿性磷酸酶的分泌，判斷藥物對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成脂分化能力和成骨分化能力的影響，找出丹參素和丹酚酸B作用的最佳濃度，并與Sirtl特異性配體白藜蘆

4、醇、降血脂藥辛伐他汀進(jìn)行比較。 3.丹參素和丹酚酸B對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂分化時(shí)Sirtl-PPARr途徑的影響： 選用傳代的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，把細(xì)胞分成：陰性對(duì)照組、成脂誘導(dǎo)對(duì)照組、成脂誘導(dǎo)+丹參素組、成脂誘導(dǎo)+丹酚酸B組、成脂誘導(dǎo)+白藜蘆醇組、成脂誘導(dǎo)+辛伐他汀組。檢測(cè)PPARr、SirtlmRNA的表達(dá)，探討丹參素和丹酚酸B是否通過Sirtl-PPARr途徑影響大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化。 結(jié)果：

5、 1.大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及脂肪分化的鑒定結(jié)合密度梯度離心法和傳代貼壁篩選法，分離純化得到較為均一成纖維細(xì)胞型的MSCs。MSCs成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶分泌增加、骨節(jié)結(jié)茜素紅染色呈陽(yáng)性；成脂誘導(dǎo)后出現(xiàn)脂肪細(xì)胞，脂滴可被油紅O紅染，油紅染色化學(xué)比色值增加，說明分離的細(xì)胞具有MSCs特性，可用于檢測(cè)藥物的作用。 2.丹參素和丹酚酸B對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞與成骨細(xì)胞分化的影響： 結(jié)合密度梯度離心法和傳代貼壁篩選法，

6、分離純化得到較為均一的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)成脂誘導(dǎo)后向脂肪細(xì)胞分化。添加脂肪誘導(dǎo)劑后大鼠MSCs分化為脂肪細(xì)胞的能力較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，油紅染色化學(xué)比色的吸光度(P<0.05)以及脂蛋白脂酶mRNA的表達(dá)也較陰性對(duì)照組明顯增強(qiáng)。成脂誘導(dǎo)加藥組的成脂分化均比誘導(dǎo)組明顯減少，丹參素、丹酚酸B、白藜蘆醇和辛伐他汀組脂肪細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例、油紅染色化學(xué)比色值和脂蛋白脂酶mRNA的表達(dá)明顯低于單純誘導(dǎo)組。丹參素的有效濃度是5×10-7mol/L

7、-1×10-6mol/L，用藥后第15天時(shí)5×10-7mol/L濃度組降低成脂能力最明顯；丹酚酸B的有效濃度是1×10-7mol/L-1×10-6mol/L，用藥后第15天時(shí)5×10-7mol/L濃度組降低成脂能力最明顯；白藜蘆醇和辛伐他汀從第9天起即明顯減少脂肪細(xì)胞的形成，第15天時(shí)降低成脂能力最明顯。丹參素和丹酚酸B降低成脂的能力不及白藜蘆醇、辛伐他?。晃覀冇^察到在這些藥物在抑制成脂的同時(shí)還促進(jìn)大鼠MSCs成骨分化，丹參素、丹酚酸B

8、、白藜蘆醇和辛伐他汀均可增加大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞堿性磷酸酶的含量，在各種藥物中1×10-7mol/L辛伐他汀的作用最明顯，其中濃度為5×10-7mol/L的丹參素和丹酚酸B在第15天的作用效果最好。 3.丹參素和丹酚酸B對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂分化時(shí)Sirtl-PPARr途徑的影響： 對(duì)照組、誘導(dǎo)組和給藥組的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后均能表達(dá)PPAR γ和SiftlmRNA。經(jīng)體外成脂誘導(dǎo)后脂肪誘導(dǎo)組MSCs

9、的PPAR γ mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，但Sirtl mRNA的表達(dá)與陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。體外成脂誘導(dǎo)后，5×10-7mol/L丹參素、5×10-7mol/L丹酚酸B、1×10-6mol/L白藜蘆醇和1×10-7mol/L辛伐他汀各組MSCs的PPAR γ mRNA表達(dá)較誘導(dǎo)組明顯降低，5x10-7mol/L丹參素組、5×10-7mol/L丹酚酸B組、1×10-6mol/L白藜蘆醇組MSCs的SirtlγmR

10、NA表達(dá)較誘導(dǎo)組明顯升高，但1×10-7mol/L辛伐他汀組MSCs的SirtlmRNA表達(dá)與誘導(dǎo)組相比無(wú)明顯差異。 結(jié)論： 丹參素和丹酚酸B均可抑制大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，使脂肪細(xì)胞生成減少、油紅染色化學(xué)比色值降低(P<0.05)，脂蛋白脂酶表達(dá)減少；還可促進(jìn)MSCs堿性磷酸酶的分泌(P<0.01)。同時(shí)丹參素和丹酚酸B可使PPARγ的mRNA表達(dá)減少，使Sirtl的mRNA表達(dá)增多，作用與Sirtl特異性配